Действие повышенной и пониженной температур инкубации на морфометрические показатели гемоцитов Anas platyrhynchos

Важной задачей современной клеточной биологии является исследование морфометрических характеристик гемоцитов, определяющих их физиологическую реактивность. Система крови является важнейшей системой организма, которая активно реагирует на различные внешние воздействия, к числу которых относится температура [10, 14, 15]. Проведен ряд исследований, затрагивающих изучение действия температур разного диапазона на морфофизиологические показатели гемоцитов Gallus domesticus [11-13]. При этом остаются не изученными вопросы, связанные с ключевыми механизмами ответных реакций клеток крови на действие разных температур инкубации у других видов птиц, в том числе домашней утки Anas platyrhynchos (Linnaeus, 1758).

Целью исследования было изучение действия повышенной и пониженной температур инкубации на морфометрические показатели гемоцитов Anas platyrhynchos в опытах in vitro.

Материал и методы исследований. Исследования проведены на базе кафедры биологии НИУ «БелГУ». В ходе работы была изучена периферическая кровь домашней утки Anas platyrhynchos (Linnaeus, 1758), полученная из подкрыльцовой вены. Всего было обследовано 15 особей [9]. Суспензии с красными и белыми клетками крови выдерживали при пониженных до 5^оС и 20^оС, повышенной – до 45^оС и контрольной (40^оС) температурах в течение двух часов

• [8] . От каждой особи отобрано и обработано не менее 100 клеток при разных температурах.

По окончании периода инкубации с помощью метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) осуществляли сканирование клеток крови в полуконтактном режиме [3, 5, 7]. Полученные сканы позволили измерить показатели площади (S, мкм2), объема (V, мкм3), большого (D, мкм) и малого (d, мкм) диаметров гемоцитов. Определение данных показателей проводили с помощью Зондовой Нанолаборатории «Интегра Вита» (NT-MDT, Россия). В работе было использовано программное обеспечение NT-VDT SPM Software – Nova 1.0.26.1397.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 [2]. Достоверность различий между выборками определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Р<0,05) [6].

Результат исследований.

Полученные при разных температурных режимах инкубации сканы эритроцитов Anas platyrhynchos представлены на рисунке 1. Вне зависимости от температуры инкубации красные клетки крови Anas platyrhynchos сохраняли овальную форму и шероховатость поверхности плазмалеммы. Ядро располагалось в центре и выступало над поверхностью эритроцита. При пониженных и повышенной температурах инкубации, по сравнению с контролем, шероховатость поверхности эритроцитов

Anas platyrhynchos была более выражена. Большая выраженность складчатости поверхности плазматической мембраны у эритроцитов Anas platyrhynchos при экстремальных условиях среды может быть обусловлена процессом дезорганизации актиновых компонентов цитоскелета, который способствует формированию актинсвязывающих доменов непосредственно под плазматической мембраной [7].

Рисунок 1 - АСМ-изображения эритроцитов Anas platyrhynchos после инкубации при температурах 5оС (а), 20оС (б), 40оС (в) и 45оС (г)

В таблице 1 представлены значения морфометрических показателей эритроцитов Anas platyrhynchos, полученные после инкубации при разных температурных режимах. Согласно данных таблицы, значение показателя площади у красных клеток крови Anas platyrhynchos после инкубации при температуре 5 оС было на 16,96 % (Р<0,05) выше, по сравнению с аналогичным показателем, полученным при инкубации в условиях контрольной температуры. При пониженной (до 5 оС) температуре инкубации, по сравнению с инкубацией при температуре 40 оС, значения показателей большого и малого диаметров у эритроцитов Anas platyrhynchos были выше на 5,66 % (Р<0,05) и 6,86 % (Р<0,05), соответственно. По сравнению с инкубацией клеток при температуре контроля, значения показателей большого и малого диаметров красных клеток крови Anas platyrhynchos, инкубированных при температуре 20 оС, были, соответственно, ниже на 5,39 % (Р<0,05) и 7,96 % (Р<0,05). При повышенной температуре инкубации регистрировали снижение показателя большого диаметра на 4,83 % (Р<0,05), по сравнению с контролем. Таким образом, как пониженная, так и повышенная температуры вызывали ответную реакцию плазмалеммы красных клеток крови, которая проявлялась в изменении их морфометрических показателей. Аналогичные изменения под влиянием разной температуры выявлены не только у ядерных эритроцитов, но и у безъядерных красных клеток крови позвоночных животных [4].

Таблица 1 - Морфометрические показатели эритроцитов Anas platyrhynchos

Показатель, ед. изм.	Температура инкубации, ° C
	5	20	40	45
Площадь, мкм2	65,53±1,59*	54,75 ±1,77	56,0±1,54	53,66±1,31
Объем, мкм3	66,64 ±2,68	61,64 ±2,53	60,3±2,23	69,08±4,20
Большой диаметр, мкм	11,3 ±0,15*	10,1 ±0,16*	10,7±0,13	10,25±0,16*
Малый диаметр, мкм	6,85±0,12*	5,90±0,13*	6,41±0,11	6,14±0,80

Примечание: * - достоверное различие по сравнению с температурой 40оС при условии Р <0,05

(t-критерий Стьюдента)

Рисунок 2 – АСМ-изображения лейкоцитов Anas platyrhynchos после инкубации при температурах 5 ^оС (а), 20 ^оС (б), 40 ^оС (в) и 45 ^оС (г)

Лейкоциты Anas platyrhynchos были округлой формы, поверхность клеток имела шероховатый вид как при пониженной, так и при повышенной температурах инкубации (Рисунок 2).

В таблице 2 представлены полученные после инкубации при разных температурных режимах морфометрические показатели полиморфноядерных лейкоцитов Anas platyrhynchos.

Снижение температуры инкубации до 5 ^оС способствовало увеличению показателей большого и малого диаметров лейкоцитов Anas platyrhynchos на 25,61 % (Р<0,05) и 24,21 % (Р<0,05), соответственно, по сравнению с контролем.

Таблица 2 – Морфометрические показатели полиморфноядерных лейкоцитов Anas platyrhynchos

Показатель, ед. изм.	Температура инкубации, oC
	5	20	40	45
Площадь, мкм2	36,49 ± 4,52	21,63 ± 0,87*	27,52 ± 1,65	23,43 ± 0,89*
Объем, мкм3	26,69 ± 3,18	23,57 ± 1,35	23,35 ± 2,41	20,76 ± 1,13
Большой диаметр, мкм	7,21 ± 0,40*	5,13 ± 0,17*	5,74 ± 0,21	5,24 ± 0,15
Малый диаметр, мкм	6,26 ± 0,45*	4,22 ± 0,15*	5,04 ± 0,12	4,65 ± 0,12*

Примечание: * – достоверное различие по сравнению с температурой 40^оС при условии р <0,05 (t-критерий Стьюдента)

Значения показателей площади, большого и малого диаметров белых клеток крови Anas platyrhynchos, инкубированных при температуре 20^оС, были, соответственно, ниже на 21,40 % (Р<0,05), 10,63 % (Р<0,05) и 16,27% (Р<0,05), по сравнению с аналогичными показателями клеток, проинкубированных при температуре 40 ^oC. Повышение температуры инкубации до 45 ^oC способствовало снижению показателей площади лейкоцитов Anas platyrhynchos на 14,86 % (Р<0,05), малого диаметра – на 7,74 % (Р<0,05), соответственно, по сравнению с контролем.

В проведенных нами ранее исследованиях было установлено, что снижение температурного режима инкубации способствует увеличению локомоционной активности клеток, что свидетельствует о повышении их защитных свойств.    Основываясь    на    этих исследованиях,     можем     косвенно предположить,      что      увеличение морфометрических параметров гемоцитов при пониженной температуре инкубации, по сравнению с клетками, инкубация которых проводилась в условиях температуры контроля, также было направлено на повышение защитных свойств клеток. Увеличение морфометрических показателей гемоцитов при пониженной температуре также можно связать с тем, что эти условия инкубации способствуют меньшим энергозатратам у птицы на осуществление работы, связанной с морфофизиологическими механизмами увеличения теплоотдачи [11]. При пониженной температуре инкубации снижается также уровень основного обмена, что позволяет клеткам больше экономить энергетический баланс.

Снижение морфометрических показателей гемоцитов после инкубации при повышенной до 45 °С температуре может являться результатом физиологической перегрузки клеток. При этом период двухчасовой инкубации, вероятно, оказался недостаточным для восстановления активности процессов, которые обеспечивают восстановление функциональной активности гемоцитов. Кроме того, повышенная температура инкубации, вероятно, способствовала изменению молекулярной топографии гемоцитов, в том числе микровязкости липидного бислоя, микроокружения белковых молекул, белок-липидных взаимодействий и других характеристик структуры плазмалеммы [11]. Известно, что при адаптации клетки к высокой температуре происходит существенное снижение конформационной гибкости белковых молекул [1]. Можно предположить, что при высокой температуре в мембране происходит нарушение регуляции фазового перехода липидов, микровязкости билипидного слоя и других свойств структурной организации мембраны [11].

Сохранение значения показателей объема при снижении и повышении температур инкубации как у эритроцитов, так и у лейкоцитов изучаемого вида животных на уровне контроля, вероятно, обусловлено активацией внутриклеточных механизмов регуляции, отвечающих за данный параметр клетки [10].

Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что как повышенная, так и пониженная температуры инкубации оказывают влияние на морфометрические показатели ядерных эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Anas platyrhynchos. Снижение температурного режима инкубации до 5 оС способствует увеличению морфометрических показателей эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Anas platyrhynchos, а инкубация клеток при пониженной (до 20 оС) и повышенной (до 45 oC) температурах, напротив, способствует снижению данных показателей, за исключением показателя объема, который является устойчивым к изменению температурного режима инкубации.

Вне зависимости от температурного режима инкубации эритроциты Anas platyrhynchos сохраняли овальную форму и шероховатость поверхности плазмалеммы. Ядро занимало центральное положение и выступало над поверхностью красных клеток крови. Лейкоциты Anas platyrhynchos при разных температурных режимах были округлой формы, поверхность клеток имела шероховатый вид.

Резюме

В работе показано действие пониженных (до 5 ^оС и 20 ^оС) и повышенной (до 45 ^оС) температур инкубации на показатели площади, объема, большого и малого диаметров эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Anas platyrhynchos . Установлено, что инкубация красных и белых клеток крови в условиях in vitro при температурах 20 ^оС и 45 ^оС способствует снижению, при температуре 5 ^оС – повышению морфометрических показателей гемоцитов Anas platyrhynchos , за исключением показателя объема, являющегося устойчивым к изменению температур инкубации. Как при пониженных, так и при повышенной температуре инкубации эритроциты Anas platyrhynchos сохраняют овальную форму, шероховатость поверхности плазмалеммы, ядро располагается в центре клетки и выступает над поверхностью плазмалеммы. Белые клетки крови Anas platyrhynchos при разных температурных режимах округлой формы, поверхность клеток имеет шероховатый вид.