Действие солей лития на лимфоциты пациентов с аддиктивными и депрессивными расстройствами в опытах in vitro

Расстройства депрессивного спектра и алкогольная зависимость в современном мире остаются социально значимыми психическими расстройствами в связи с их широкой распространенностью, медико-социальной тяжестью последствий этих заболеваний, сложностью лечения и зачастую неблагоприятным прогнозом. В терапии аффективных расстройств и алкогольной зависимости с аффективными нарушениями применяются препараты лития, чаще всего в виде карбоната [1, 2].

В последние годы вновь активизировался интерес к литиевой терапии [3, 4] и возникла необходимость изыскания, разработки и изучения инновационных перспективных импортозамещающих препаратов лития. Актуальным направлением является создание препаратов лития с комбинированным нормотимическим, нейропротекторным и антиоксидантным действием, направленным на важнейшие звенья патогенеза расстройств аффективного спектра и синдрома зависимости. С целью выбора наиболее перспективных соединений в рамках решения этой задачи ранее на моделях плазмы и клеток крови больных алкоголизмом была проведена сравнительная оценка антиоксидантного, гемопротекторного, цитопротектор-ного действия солей лития, синтезированных на основе аскорбиновой кислоты и субстратов цикла Кребса [5, 6, 7, 8, 9].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение в опытах in vitro влияния солей лития (пирувата, сукцината, фумарата, аскорбата и карбоната) на модуляцию репертуара поверхностных рецепторов лимфоцитов периферической крови больных алкогольной зависимостью и депрессивным расстройством.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования были образцы крови, взятые у 22 больных алкогольной зависимостью и 21 пациента с депрессивным расстройством, поступивших на лечение в клинику НИИ психического здоровья Томского НИМЦ. Диагноз больных алкоголизмом по МКБ-10 квалифицировался как «Психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя (синдром зависимости – F10.21 и синдром отмены – F10.30)»; диагноз пациентов с депрессивными расстройствами – как «Депрессивный эпизод – F32» и «Рекуррентное депрессивное расстройство – F33». Забор крови осуществляли из локтевой вены утром натощак с использованием системы Vacutainer с антикоагулянтом EDTA.

Субпопуляционный состав лимфоцитов дифференцировали по поверхностным рецепторам на проточном цитометре системы BD FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с применением набора реактивов этой фирмы. Выявляли общий пул лимфоцитов (CD45+), Т-клетки (CD3+CD19-), Т-хелперы (CD3+CD4+), цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+), натуральные клетки-киллеры (CD3-CD16+CD56+), ТNK-клетки (CD3+CD16+CD56+), В-лимфоциты (CD3-CD19+), активированные Т-клетки (CD3+HLA-DR+), активированные лимфоциты фенотипа (CD3-HLA-DR+), клетки с Fas-рецепторами готовности к апоптозу – Fas/APO-1 (CD3+CD95+). Количество клеток выражали в процентах (%) от общего числа лимфоцитов (CD45+). Количество клеток в нативных образцах крови обозначали как фоновые показатели популяций лимфоцитов у пациентов.

Соли лития (лития сукцинат, лития фумарата, лития пируват, лития аскорбат и лития карбонат) взвешивали на аналитических весах, растворяли в физиологическом растворе и получали маточные растворы с удобной концентрацией для дальнейшего внесения в экспериментальные нагрузочные пробы до конечной стандартной концентрации 1,2 ммоль/л в расчете на ион лития (Li+). Эта концентрация соотносится с терапевтической дозой лития при применении в терапии расстройств аффективного спектра. Карбонат лития использовали в качестве соли сравнения, поскольку эта соль является основой большинства применяемых в медицинской практике препаратов лития.

Модуляцию репертуара поверхностных рецепторов лимфоцитов при действии солей лития оценивали следующим методом: в стериль- ных условиях цельную кровь разводили 1:1 полной средой RPMI-1640 с добавлением гентамицина, разведенную кровь вносили в лунки культурального планшета Cell Culture Plate (24-Well, Eppendorf), добавляли растворы солей лития до конечной стандартной концентрации лития, инкубировали в течение суток при температуре 370С в СО2-инкубаторе. После инкубации осторожно отбирали часть супернатанта, в осадке клеток определяли количество субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии. Параллельно к опытным пробам ставили контроль со средой RPMI-1640.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета программ STATISTICA для Windows, версия 12.0. Описательная статистика представлена медианой (Ме) и межквартильным интервалом (LQ–UQ). Для внутригруппового сравнения использовался критерий Краскела–Уоллиса; для межгруппового сравнения применяли критерий Манна– Уитни. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Данные эксперимента на клетках крови больных алкогольной зависимостью приведены в таблице 1.

Инкубация в течение суток образцов крови как в среде RPMI (контроль), так и в нагрузочных пробах с солями лития приводила к модуляции субпопуляционного состава мононукле-аров по сравнению с фоновыми показателями (количество периферических лимфоцитов в нативных пробах крови пациентов). Это выражалось в стимуляции экспрессии рецепторов и повышении количества Т-лимфоцитов (CD3+CD19-) и их субпопуляций (хелперов/ индукторов и цитотоксических Т-лимфоцитов), ТNK-клеток, а также в супрессии рецепторов и снижении количества В-лимфоцитов (CD3-CD19+), натуральных клеток-киллеров (CD3-CD16+CD56+) и активированных мононуклеаров с антигеном дифференцировки HLA-DR.

Следует отметить, что фактическое влияние солей лития на поверхностные рецепторы лимфоцитов отражают сравнительные данные, полученные в нагрузочных и в контрольных пробах. При сравнении этих данных выявлено, что стимулирующее влияние на экспрессию рецепторов Т-хелперов (CD3+CD4+) оказывали все соли лития, кроме фумарата. В нагрузочных пробах с сукцинатом, карбонатом и аскорбатом лития количество активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+) было выше, чем в контрольных.

Т а б л и ц а 1. Влияние солей лития на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов больных алкоголизмом в условиях суточной инкубации – Me (LQ–UQ)

Фенотипы лимфоцитов, %	Фоновые показатели (n=22)	Нагрузочные пробы (доза солей лития 1,2 ммоль/л)					Контрольные пробы (n=22)
		1 (n=22)	2 (n=22)	3 (n=22)	4 (n=22)	5 (n=22)
Т-лимфоциты CD3+CD19-	78,00 (70,00; 82,00)	84,00 (77,00; 89,00)*	83,00 (76,00; 88,00)*	82,50 (76,00; 91,00)*	82,50 (76,00; 90,00)*	82,50 (77,00; 90,00)*	81,00 (76,00; 90,00)*
Т-хелперы-индукторы CD3+CD4+	46,00 (43,00; 55,00)	54,50 (46,00; 61,00)* #	54,50 (46,00; 61,00)*	55,00 (47,00; 60,00)* #	54,00 (47,00; 61,00)* #	55,00 (47,00; 59,00)* #	54,00 (47,00; 58,00)*
Цитотоксические Т-лимфоциты CD3+CD8+	24,00 (19,00; 32,00)	27,00 (19,00; 33,00)*	26,00 (19,00; 32,00)*	26,00 (20,00; 34,00)*	25,00 (19,00; 34,00)* #	25,50 (19,00; 34,00)*	26,00 (19,00; 35,00)*
В-лимфоциты CD3-CD19+	9,00 (8,00; 12,00)	7,00 (5,00; 9,00)*	6,50 (5,00; 8,00)*	6,00 (4,00; 8,00)*	7,00 (5,00; 9,00)*	6,00 (4,00; 9,00)*	7,00 (4,00; 8,00)*
Натуральные клетки-киллеры CD3-CD16+CD56+	11,50 (8,00; 18,00)	8,50 (6,00; 12,00)*	10,00 (5,00; 13,00)*	10,00 (5,00; 14,00)*	9,00 (5,00; 13,00)*	10,00 (5,00; 13,00)* #	12,00 (3,00; 15,00)*
Т-NK-клетки CD3+CD16+CD56+	2,00 (1,00; 3,00)	4,00 (3,00; 8,00)*	4,00 (3,00; 8,00)*	4,00 (3,00; 10,00)*	3,00 (3,00; 8,00)*	4,00 (3,00; 7,00)*	4,00 (3,00; 11,00)*
Активированные Т- и В-клетки CD3+HLA-DR+	3,00 (2,00; 4,00)	2,00 (1,00; 3,00)#	2,00 (1,00; 2,00)*	2,00 (2,00; 3,00)	2,00 (2,00; 3,00)#	2,00 (2,00; 3,00)#	2,00 (1,00; 2,00)*
Активированные В-клетки CD3-HLA-DR+	10,00 (8,00; 12,00)	7,00 (5,00; 9,00)*	7,00 (4,00; 9,00)*	7,00 (5,00; 9,00)*	7,00 (5,00; 9,00)*	7,00 (5,00; 9,00)* #	6,00 (5,00; 8,00)*
Fas/Apo-1 CD3+CD95+	3,00 (2,00; 3,00)	2,00 (1,00; 3,00)	2,00 (1,00; 3,00)	2,00 (1,00; 3,00)	2,00 (2,00; 3,00)	2,00 (1,00; 3,00)	2,00 (1,00; 3,00)

П р и м е ч а н и е . 1 – Лития сукцинат; 2 – лития фумарат; 3 – лития пируват; 4 – лития карбонат; 5 – лития аскорбат; * – p<0,05 при сравнении с фоновыми показателями (количество периферических лимфоцитов у пациентов); # – p<0,05 при сравнении с контрольными пробами (среда RPMI).

В целом можно сделать заключение, что соли лития в условиях эксперимента оказывают различное влияние на лимфоциты крови больных алкоголизмом. При этом наименьшее модулирующее воздействие на экспрессию поверхностных рецепторов оказывали фумарат и пируват лития. Наиболее активным действием характеризуются аскорбат и карбонат лития.

В таблице 2 представлены результаты исследования модулирующего влияния солей лития на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов в образцах суточной культуры клеток крови пациентов с депрессивными расстройствами.

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что суточная инкубация клеток крови больных депрессивными расстройствами оказывала разные эффекты на популяционный репертуар лимфоцитов периферической крови.

Во всех экспериментальных пробах (нагрузочных и контрольных) по сравнению с фоновыми показателями зарегистрировано повышение количества общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+CD19-), ТNK-клеток (CD3+D16+CD56+), а также снижение количества В-лимфоцитов (CD3-CD19+), активированных лимфоцитов фенотипа (CD3-HLA-DR+), клеток с Fas-рецепторами готовности к апоптозу (CD3+CD95+). Установлено, что суточная инкубация клеток крови не оказывала влияния на количество Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), натуральных клеток-киллеров (CD3-CD16+CD56+) и активированных Т-клеток фенотипа CD3+HLA-DR+, количество которых во всех экспериментальных пробах было сравнимо с фоновыми показателями.

Т а б л и ц а 2. Влияние солей лития на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов периферической крови больных депрессивными расстройствами в условиях суточной инкубации – Me (LQ–UQ)

Фенотипы лимфоцитов, %	Фоновые показатели (n=21)	Нагрузочные пробы (доза солей лития 1,2 ммоль/л)					Контрольные пробы (n=21)
		1 (n=21)	2 (n=21)	3 (n=21)	4 (n=21)	5 (n=21)
Т-лимфоциты CD3+CD19-	75,50 (72,00-78,50)	83,00 (76,0086,50)	84,00 (77,0086,00)*	84,50 (75,0086,50)*	83,00 (76,5087,00)*	82,50 (76,0086,00)*	82,50 (75,50-85,00)*
Т-хелперы-индукторы CD3+CD4+	50,00 (45,50-55,50)	55,00 (49,5063,00)	56,50 (49,5063,00)	54,50 (47,0062,50)	56,00 (50,5062,50)	56,00 (48,0063,00)	55,00 (49,50-62,00)
Цитотоксические Т-лимфоциты CD3+CD8+	25,50 (21,50-30,00)	27,50 (21,0031,00)	27,50 (21,0032,50)	27,50 (21,5033,50)	26,00 (22,0033,00)	25,50 (22,0032,50)	27,00 (21,50-32,50)
В-лимфоциты CD3-CD19+	11,00 (8,00-15,00)	7,00 (5,509,50)*	7,50 (4,50 9,50)*	7,50 (5,509,00)*	7,50 (5,5010,00)*	7,50 (5,5010,00)*	7,50 (6,00-9,50)*
Натуральные клетки-киллеры CD3-CD16+CD56+	12,00 (8,00-15,00)	8,00 (6,0015,50)	8,00 (5,5016,50)	7,50 (5,00 16,50)	8,00 (5,5015,00)	8,00 (6,0016,50)	10,50 (7,00-16,50)
ТNK-клетки CD3+CD16+CD56+	2,50 (1,00-4,00)	5,50 (3,008,00)*	5,00 (2,508,00)*	5,50 (3,008,00)*	6,00 (3,008,50)*	5,50 (2,509,00)*	6,00 (3,00-10,00)*
Активированные лимфоциты CD3-HLA-DR+	10,00 (8,00-16,00)	6,50 (5,009,00)*	7,00 (5,009,00)*	6,50 (5,007,00)*	7,50 (4,009,00)*	6,00 (5,008,00)*	7,50 (5,00-9,00)*
Активированные Т-клетки CD3+HLA-DR+	2,00 (1,00-3,00)	1,00 (1,003,00)	1,00 (1,003,00)	1,00 (1,003,00)	1,00 (1,002,00)	1,00 (1,003,00)	1,00 (1,00-3,00)
Fas/Apo-1 CD3+CD95+	3,00 (3,00-3,00)	2,50 (1,003,00)	1,00 (1,002,00)	1,00 (1,003,00)*	1,50 (1,002,00)*	1,00 (1,003,00)*	1,50 (1,00-2,00)*

П р и м е ч а н и е. 1 – Лития сукцинат; 2 – лития фумарат; 3 – лития пируват; 4 – лития карбонат; 5 – лития аскорбат; контрольные пробы (среда RPMI); * – p<0,05 при сравнении с фоновыми показателями (количество периферических лимфоцитов у пациентов).

При сравнительном анализе результатов в нагрузочных и контрольных пробах установлено, что инкубация клеток крови пациентов с депрессивными расстройствами в среде RPMI-1640 с солями лития и в отсутствии солей лития оказывала однонаправленное действие на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов. Иными словами, соли лития в условиях эксперимента не оказывали влияния на лимфоциты.

Поиск и выбор перспективных соединений для создания новых фармакологических средств с комбинированным терапевтическим эффектом основан на изучении механизма их действия на различных биологических моделях. Удобной и адекватной моделью для оценки различных процессов, протекающих в организме, являются лимфоциты периферической крови, которые имеют рецепторы к различным медиаторам, в частности к нейромедиаторам, и, по мнению многих авторов, отражают состояние гомологичных рецепторов в головном мозге [10, 11, 12]. В настоящем исследовании для более полной характеристики биологических эффектов солей лития изучено их воздействие на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов периферической крови пациентов с аддиктивными и аффективными расстройствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом можно заключить, что суточная инкубация в среде RPMI клеток крови больных алкогольной зависимостью и депрессивными расстройствами с сукцинатом, фумаратом, пируватом и аскорбатом лития оказывает однонаправленное действие с препаратом сравнения – карбонатом лития – на изменение репертуара поверхностных рецепторов лимфоцитов. Результаты анализа данных экспериментов в нагрузочных пробах с солями лития и в контрольных пробах без солей лития, выявляющих фактическое влияние соединений лития на лимфоциты, показали, что исследуемые соли не оказывают влияния на экспрессию поверхност- ных рецепторов лимфоцитов крови пациентов с депрессивными расстройствами. В отношении лимфоцитов крови больных алкогольной зависимостью наиболее активным действием характеризовался аскорбат лития, а наименее активным – фумарат лития, что, в определенной степени, можно отнести к его позитивным свойствам.

Принимая во внимание выявленный ранее комбинированный антиоксидантный, цитопро-текторный эффект аскорбата лития, сукцината лития и пирувата лития [6, 7, 8, 9], а также способность аскорбата лития и фумарата повышать устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к гемолизу, индуцированному этанолом [5, 13], можно сделать заключение в отношении этих соединений как наиболее перспективных для разработки новых фармакологических средств. Анализируемые соли лития не оказывали негативного влияния на мембраны лимфоцитов в условиях эксперимента, что является одним из аргументов дальнейшего изучения их биологического потенциала и сравнительного анализа с данными других экспериментов в рамках Проекта с целью выявления наиболее перспективных соединений с комбинированным нормотимическим, нейропротек-торным и антиоксидантным действием.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование проведено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 17-75-20045), частично (набор пациентов) исследование выполнено за счет бюджетного финансирования темы (шифр темы 0550-2019-0007).

СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ

Исследование проведено с соблюдением норм современной биомедицинской этики и этических стандартов, разработанных в соответствии с Хельсинской декларацией ВМА, и одобрено Локальным этическим комитетом при НИИ психического здоровья Томского НИМЦ (протокол № 361 от 23.10.2017 г.).