Дифференциация штаммов бруцелл на основе анализа вариабельности VNTR-локусов

Автор: Анисимова Е.А., Додонова Е.А., Миргазов Д.А., Зайнуллин Л.И., Осянин К.А.

Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau

Статья в выпуске: 4, 2024 года.

Бесплатный доступ

Цель исследования - оценка эффективности применения разработанного протокола проведения MLVA для дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза. Данный протокол включает в себя анализ 15 VNTR-локусов с использованием модифицированных MLVA-праймеров. Для in vitro апробации предложенной MLVA схемы использовали выделенную нами ранее ДНК штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L, B melitensis 1565. MLVA проводили методом ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле. Положительная амплификация наблюдалась для 10 из 15 VNTR-локусов, а именно Bru6, Bru7, Bru9, Bru16 и Bru18, Bru19, Bru21, Bru30, Bru43 и Bru45. Молекулярный размер данных локусов для референтных штаммов B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 подтвердили in silico. Также представлены результаты MLVA для штаммов, представленных в базе данных GenBank. Путем поисковых запросов баз данных ресурсов NCBI нами были получены геномные последовательности 49 штаммов бруцелл видов B. canis, B. suis, B. aborus, B melitensis. C помощью биоинформационного анализа для данных штаммов определили молекулярную массу каждого из десяти VNTR-локуса и количество повторов в нем. По результатам проведенного MLVA построили дендрограмму. На основании филогенетического анализа последовательностей десяти вариабельных локусов установлено, что большинство исследуемых штаммов бруцелл распределились на дендрограмме в соответствии с их таксономическим положением. Таким образом заключили, что предложенный нами MLVA-протокол имеет потенциал использования для дифференциации штаммов бруцелл.

Еще

Brucella, mlva, пцр, филогенетический анализ, тандемные повторы, бруцеллез

Короткий адрес: https://sciup.org/140306673

IDR: 140306673 | DOI: 10.36718/1819-4036-2024-4-53-60

Текст научной статьи Дифференциация штаммов бруцелл на основе анализа вариабельности VNTR-локусов

Введение. Бруцеллез – опасное заболевание животных и человека, распространенное преимущественно в странах с интенсивным животноводством [1]. К бруцеллезу восприимчивы все виды теплокровных животных, но чаще всего данное заболевание встречается у крупного рогатого скота, свиней, оленей, коз, овец, лошадей и собак. В России эпидемиологическая ситуация по данному заболеванию также характеризуется как достаточно напряженная [2]. В частности, основная часть случаев заболеваемости регистрируется на территориях СевероКавказского, Южного и Сибирского федеральных округов, в которых отмечается самая высокая заболеваемость крупного рогатого скота (более 80 % от общего количества больных животных в РФ) и мелкого рогатого скота (более 90 %) [3]. Эпидемическую ситуацию по бруцеллезу осложняет возможность вспышечной заболеваемости людей данным заболеванием [4]. Для человека наиболее патогенными считаются виды B. melitensis, B. abortus, B. suis и B. canis, заражение которыми может происходить при непосредственном контакте с инфицированными животными или при употреблении в пищу непастеризованных продуктов животного происхождения [5]. Необходимость применения современных молекулярно-генетических методов для проведения точной идентификации и типи-рования возбудителей бруцеллеза не вызывает сомнений. В частности, для молекулярного ти-пирования возбудителей особо опасных инфекций успешно используется MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis), представляющий собой сравнительный анализ вариабельности областей генома (VNTR-локусов), содержащих тандемные повторы [6]. Что касается бруцелл, данный метод отражает генетический полиморфизм у штаммов Brucella sp. и позволяет не только проводить внутривидовую дифференциацию, но и группировать штаммы возбудителей бруцеллеза в соответствии с их географическим про- исхождением [7, 8]. Ранее в качестве метода генотипирования бруцелл нами был предложен MLVA протокол, включающий в себя анализ 15 VNTR-локусов, содержащих тандемные повторы от 6 до 134 п. н. [9]. Принципиальным отличием данного подхода от других существующих схем исследования геномного полиморфизма бру-целл является использование оригинальной системы VNTR-праймеров, представляющих собой претерпевшие редизайн традиционно применяемые для MLVA олигонуклеотидные затравки. Однако отметим, что ранее нами был выполнен только теоретический подбор праймеров и необходимых условий ПЦР.

Цель исследования – оценка эффективности применения разработанного протокола проведения MLVA для дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

Материалы и методы. В работе использовали данные о геномных последовательностях 49 штаммов бруцелл, представленных в базе данных GenBank (табл. 1). Биоинформационный анализ проводили с помощью программ Vector NTI 9.1 и онлайн-ресурсов NCBI (URL: .

Таблица 1

Штамм	Географическое происхождение	Номер в базе данных GenBank
1	2	3
Brucella canis strain RM6/66	Коллекция (США)	CP007758.1, CP007759.1
Brucella canis strain FDAARGOS_420		CP023974.1, CP023973.1
Brucella canis ATCC 23365		CP000872.1, CP000873.1
Brucella canis str. Oliveri		HG803175.1, HG803176.1
Brucella canis strain 2010009751	США (Массачусетс)	CP016977.1, CP016978.1
Brucella canis strain 2009013648	США (Аризона)	CP016975.1, CP016976.1
Brucella canis strain 2009004498	США (Луизиана)	CP016973.1, CP016974.1
Brucella canis strain SVA13	Швеция	CP007629.1, CP007630.1
Brucella canis HSK A52141	Корея	CP003174.1, CP003175.1
Brucella canis strain GB1	Китай	CP027643.1, CP027642.1
Brucella suis 1330	Коллекция (США)	AE014291.4, AE014292.2
Brucella suis bv. 1 strain CVI_59	Хорватия	CP054959.1, CP054960.1
Brucella suis bv. 1 strain CVI_58	Хорватия	CP054961.1, CP054962.1
Brucella suis bv. 1 str. S2	Китай	CP006961.1,CP006962.1
Brucella suis bv. 2 strain CVI_50	Хорватия	CP054963.1, CP054964.1
Brucella suis bv. 2 strain Bs364CITA	Португалия	CP007697.1, CP007698.1
Brucella suis bv. 2 strain PT09172	Португалия	CP007693.1, CP007694.1
Brucella suis bv. 3 str. 686	Коллекция (США)	CP007719.1, CP007718.1
Brucella suis bv. 3 strain CVI_71	Хорватия	CP054957.1, CP054958.1
Brucella suis bv. 4 strain CVI_72		CP054955.1,CP054956.1
Brucella suis bv. 5 strain CVI_73		CP054953.1,CP054954.1
Brucella melitensis bv. 1 str. 16M	Коллекция (США)	AE008917.1, AE008918.1
Brucella melitensis bv. 2 str. 63/9	Коллекция (США)	CP007789.1, CP007788.1
Brucella melitensis strain 2008724259	США (Калифорния)	CP016983.1, CP016984.1
Brucella melitensis strain CIIMS-NV-1	Индия	CP029756.1, CP029757.1
Brucella melitensis strain BL	Китай	CP022875.1, CP022876.1
Brucella melitensis strain B15		CP035795.1, CP035796.1
Brucella melitensis M5-90		CP001851.1, CP001852.1
Brucella melitensis strain CIT21		CP025819.1, CP025820.1
Brucella melitensis strain C-573	Россия (Ставрополь)	CP019679.1, CP019680.1
Brucella melitensis BwIM_SYR_04	Сирия	CP018512.1, CP018513.1
Brucella melitensis BwIM_SYR_26	Сирия	CP018526.1, CP018527.1
Brucella melitensis BwIM_IRN_28	Иран	CP018484.1, CP018485.1

Окончание табл. 1

1	2	3
Brucella melitensis BwIM_IRQ_32	Ирак	CP018490.1, CP018491.1
Brucella melitensis BwIM_TUR_38	Турция	CP018552.1, CP018553.1
Brucella melitensis BwIM_ITA_55	Италия	CP018496.1, CP018497.1
Brucella abortus 2308	Коллекция (США)	AM040264.1, AM040265.1
Brucella abortus biovar 1 str. 9-941		AE017223.1, AE017224.1
Brucella abortus bv. 2 str. 86/8/59		CP007765.1, CP007764.1
Brucella abortus bv. 6 str. 870		CP007709.1, CP007710.1
Brucella abortus 104M	Китай	CP009625.1, CP009626.1
Brucella abortus strain clpP		CP044338.1, CP044339.1
Brucella abortus strain MC		CP022879.1, CP022880.1
Brucella abortus strain CIIMS-NV-4	Индия	CP025743.1, CP025744.1
Brucella abortus strain IVRI95	Индия	CP034695.1, CP034696.1
Brucella abortus strain 69841	Италия	CP098117.1, CP098118.1
Brucella abortus strain 24157	Италия	CP098085.1, CP098086.1
Brucella abortus A13334	Южная Корея	CP003176.1, CP003177.1
Brucella abortus strain 68	Украина (Луганск)	CP066175.1, CP066176.1

Использованные в работе штаммы бруцелл из базы данных GenBank

Множественное выравнивание выполнили с использованием алгоритма MUSCLE в программе Mega 11 . Филогенетический анали з осуществляли методом попарного невзвешенного кла-стирования с арифметическим усреднением (UPGMA). Для оценки достоверности филогенетических связей использовали многократную генерацию методом Bootstrap для 1000 независимых построений каждого филогенетического дерева .

Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали выделенную нами ранее ДНК штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B melitensis 1565 [10, 11]. Амплификацию VNTR-локусов проводили согласно протоколу, представленному в работе Хаммадо-ва с соавт. [9]. Полученные ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Визуализацию проводили с помощью UV- трансиллюминатора. Размер полученных фрагментов определяли с использованием программы «Gel Analyzer» путем сравнения фрагмента с маркером молекулярной массы ДНК «100 + bp DNA Ladder» (ЗАО «Евроген», Москва).

Результаты и их обсуждение. В рамках текущего исследования провели апробацию разработанного нами ранее MLVA-подхода с использованием ДНК бактерий B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B. melitensis 1565, а также нуклеотидных последовательностей бру-целл, представленных в базе данных GenBank. На первом этапе работы определили размеры получаемых VNTR-локусов штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B. meli-tensis 1565 с помощью ПЦР и последующего электрофореза. Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика VNTR - локусов исследуемых штаммов бруцелл

Локус	Молекулярный размер локуса, п.н.
Локус	B. canis RM 6/66	B. suis 1330	B. suis 183-L	B. melitensis 1565
1	2	3	4	4
Bru4	–	–	–	–
Bru6	273	273	273	273
Bru7	165	165	165	157
Bru8	–	–	–	–
Bru9	160	144	160	152
Bru10	–	–	–	–

Окончание табл. 2

1	2	3	4	5
Bru11	–	–	–	–
Bru16	168	168	160	152
Bru18	146	138	166	138
Bru19	170	164	184	178
Bru21	175	175	159	167
Bru30	129	129	121	185
Bru43	163	163	151	175
Bru43	188	188	134	152

Поскольку амплификация локусов Bru4, Bru8, Bru10, Bru11 и Bru55 для используемых штаммов была отрицательной, данные локусы были исключены из дальнейшей работы. Штаммы B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 использовали в качестве референтных. Геном данных бактерий полностью секвенирован и представлен в базе данных GenBank, поэтому для B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 с помощью биоинформационного анализа подтвердили размер оставшихся в работе десяти VNTR-локусов, после чего путем экстраполяции также определили точный молекулярный размер данных локусов для штаммов B. suis 183-L и B. melitensis 1565.

На следующем этапе работы провели MLVA для 49 штаммов бруцелл, представленных в базе данных GenBank (см. табл. 1). Для этого с помощью программы Vector NTI 9.1 нуклеотидные последовательности I и II хромосом бру-целл ограничили разработанными для аплифи-кации VNTR-локусов праймерами, после чего определили молекулярный размер соответствующего VNTR-локуса и количество повторов в нем. Далее построили дендрограмму, представленную на рисунке.

Установили, что штаммы B. canis распределились на дендрограмме по трем близкородственным кластерам, два из которых являются общими с представителями вида B. suis. В частности, самый большой кластер сформирован штаммами B. canis и B. suis (I, IV биовара), располагающимися на соседних ветках, но выходящими из разных узлов. Штамм B. canis GB1, в свою очередь, сгруппировался вместе с кладой, состоящей из двух штаммов B. suis III биовара. Данный факт свидетельствует о генетическом родстве видов B. canis и B. suis, что находит подтверждение в исследованиях отечественных и зарубежных авторов [8, 11, 12]. Что касается остальных использованных штаммов B. suis, представители II биовара данного вида сгруппировались на дендрограмме в виде клады и близкородственной к ней ветви филогенетического древа. Обособленное положение также занял штамм B. suis V биовара, что согласуется с данными литературы о таксономии бруцелл [8]. Также родственную, но удаленную от других штаммов B. suis ветвь образует штамм B. suis 183-L, использованный в исследовании для апробации MLVA-подхода.

Другой тест-штамм – B. melitensis 1565 – сгруппировался в отдельную кладу с референтным штаммом B. melitensis 16М. Штаммы B. melitensis из базы данных GenBank образуют на дендрограмме три общих c представителями вида B. abortus кластера и группируются согласно их видовой принадлежности. В частности, штаммы B. abortus А13334, 68, IVRI95, 69841, 9-941 и CIIMS-NV-4 объединены в одну подгруппу внутри самого большого кластера, остальная часть которого представлена штаммами B. melitensis различного географического происхождения.

Штаммы B. abortus 86/8/59 и 104М образуют самостоятельную кладу, выходящую из общего узла со штаммами B. melitensis B15, M5-90, Bwl V IRQ 32. Аналогичным образом в другом кластере расположились штаммы B. abortus 870 и МС. Отдельно расположился кластер, сформированный коллекционным штаммом B. abortus 2308 и кладой, представленной изолятами из Китая ( B. abortus clP) и Италии ( B. abortus 24157).

Дендрограмма, иллюстрирующая кластеризацию исследованных штаммов бруцелл на основании проведенного MLVA-анализа (черными кругами обозначены штаммы, для которых VNTR-профиль определен in vitro; белыми – референтные штаммы)

Заключение . Проведенный по десяти вариабельным локусам MLVA-анализ позволяет систематизировать большинство использованных из базы данных GenBank штаммов бруцелл в соответствии с их таксономическим положением. Из чего можно сделать вывод, что данный подход к MLVA-типированию может быть использован для дифференциации представителей рода Brucella при проведении эпизоотологических расследований вспышек бруцеллеза.

Список литературы Дифференциация штаммов бруцелл на основе анализа вариабельности VNTR-локусов

Анализ заболеваемости людей бруцеллезом и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Brucella melitensis на длительно неблагополучных по бруцеллезу территориях юга европейской части России / А.А. Хачатурова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022. 99(1). С. 63-74. DOI: 10.36233/ 0372-9311-185.
Салмаков К.М., Косарев М.А. Совершенствование системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и препарата из штамма B. abortus R-1096 // Ветеринария. 2023. № 8. С. 9-13. DOI: 10.30896/0042-4846.2023.26.8.09-13.
Прошлое, настоящее, перспективы и проблемы совершенствования специфической профилактики бруцеллеза / В.А. Коршенко [и др.] // Медицинский вестник Юга России. 2021.№ 12 (3). С. 12-21. DOI: 10.21886/ 2219-8075-2021-12-3-12-21.
Анализ заболеваемости бруцеллезом и молекулярно-генетическая характеристика популяции бруцелл на территории Российской Федерации / Д.Г. Пономаренко [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 2. С. 61-74. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-261-74.
In vitro antimicrobial susceptibility testing of human Brucella melitensis isolates from Qatar between 2014-2015 / A. Deshmukh [et al.] // BMC Microbiol. 2015. № 15 (121). DOI: 10.1186/s12866-015-0458-9.
Дифференциация штаммов Bacillus anthra-cis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов / Н.А. Фахрутдинов [и др.] // Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 41-46. DOI: 10.33632/1998-698X_2023_ 2_41.
Изучение генетического разнообразия штаммов бруцелл, выделенных в СевероКавказском федеральном округе / И.В. Кузнецова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 3. C. 58-62. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-58-62.
Кулаков Ю.К., Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в различных регионах России // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 4. С. 2833. DOI: 10.3103/S0891416812040052.
Маркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммов / Н.И. Хаммадов [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2018. № 3. С. 88-93. DOI: 10.21055/0370-10692018-3-88-93.
Использование кривых плавления амплико-нов VNTR-локусов для идентификации бруцелл / Е.А. Анисимова [и др.] // Перспективы развития современной ветеринарной науки: сб. науч. тр. по итогам Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 55-летию Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринар. ин-та - филиала ФГБНУ «ФАНЦ РД» (22-23 сентября 2022 г.). Махачкала: Алеф, 2022. С. 22-26.
Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл / Е.А. Анисимова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 4. С. 42-49. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-4-42-49.
Genetic and Phenotypic Characterization of the Etiological Agent of Canine Orchiepididymitis Smooth Brucella sp. BCCN84.3 / C. Guzman-Verri [et al.] // Front. Vet. Sci. 2019. № 6 (175). DOI: 10.3389/fvets.2019.00175.

Еще

Статья научная