Дифференциальная диагностика возбудителей нозематоза пчёл

Оценивая результаты зимовки, пчеловоды нередко обнаруживают ослабленные пчелиные семьи, сырость внутри гнезда, опоношенность внутренних стенок улья, а в некоторых случаях гибель маток. Причиной такого состояния может быть бактериальная кишечная инфекция, недоброкачественные корма в период зимовки, а также классическое проявление нозематоза. Для уточнения диагноза необходимо исследовать пробы пчел на нозематоз, а корма на падь и наличие веществ токсичных для пчел.

Впервые на возбудителя этого заболевания обратил внимание Денгофф-Лейкарт, который в 1857 году принял их за споры грибов. В 1863 году Лейдик выявил их сходство по форме со спорами пебрины шелковичного червя – Nosema bombycis . В 1906 и 1907 гг. почти одновременно возбудителем заинтересовались английские исследователи и Е. Цандер [7]. В 1909 году Е. Цандер опубликовал статью с описанием возбудителя Nosema apis (Zander, 1909). До 70-х годов было проведено много исследований вышеназванного патогена пчёл. В 1996 г. был описан новый возбудитель нозематоза – Nosema ceranae (Fries et al., 1996), выделенный из дальневосточной пчелы Apis cerana . С начала 2000 годов по всему миру прокатилась волна гибели пчелиных семей (Higes et al., 2005; Chauzat, 2007). В России на эту проблему пчеловоды обратили внимание в 2002 году [5], когда на многих пасеках наблюдался «осенний слет» пчел. При анализе причин такого явления наряду с варроатозом, вирусными заболеваниями и отравлениями, не исключалось патогенное воздействие нового возбудителя нозематоза – N. ceranae (Higes et al., 2005). N. ceranae распространен почти во всем мире (Higes et al., 2005; Chauzat, 2007; Paxton et al., 2007; Chen et al., 2008; Fries et al., 2010). Исследования показывают, что N. ceranae уже длительное время существовал на пасеках: в США с 1995 года (Chen et al., 2008), в Европе (Финляндии) с 1998 года (Paxton et al., 2007).

В настоящее время в России в ветеринарных лабораториях нозематоз диагностируют в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на нозематоз медоносных пчёл», утвержденными 25 апреля 1985 года.

При работе с пчелами, зараженными возбудителями нозематоза, мы обнаружили, что споры различаются по форме и размерам, и предположили их принадлежность к двум разным видам. В связи с этим мы провели их морфометрию и генотипирование.

Морфометрические исследования окрашенных мазков из водной суспензии брюшек пчел показали наличие двух отчетливо различимых типов спор микроспоридий. Первый тип спор – широкие, овальные, 4,92 х 2,78 мкм (n=100). Споры второго типа узкие, овальные, некоторые с заостренным концом, 4.24 × 2.16 мкм (n=80). Пробы ДНК, выделенные из спор первого типа, дают положительную реакцию с праймерами Apis 312-F/R (Martín-Hernández, 2007) и не реагируют с праймерами Mitoc 218-F/R (Martín-Hernández, 2007), что соответствует диагнозу N. apis. Размер амплифицированного фрагмента соответствует ожидаемому – около 300 п.н. И, наоборот, пробы ДНК спор второго морфотипа дают положительную реакцию с праймерами Mitoc 218-F/R и не дают с праймерами Apis 312-F/R, что соответствует диагнозу N. ceranae. Размер амплифицированного фрагмента также соответствует ожидаемому – около 200 п.н. Для верификации диагноза, поставленного с помощью видоспецифичных праймеров, полученные ПЦР-продукты были секвенированы. Последовательность нуклеотидов рибосомальной ДНК спор первого морфотипа показала строгое соответствие сиквенсу N. apis, депонированному в Генбанке под номером U97150, и отличие от сиквенса N. ceranae (номер U26533) на 8,4%. Аналогично, последовательность нуклеотидов рДНК спор второго типа показала строгое соответствие сиквенсу N. ceranae депонированному в Генбанке под номером U26533, и отличие от сиквенса N. apis (номер U97150) на 15,7%. Таким образом, подтверждена пригодность метода видоспецифичной ПЦР-диагностики для наших исследований [2].

На основании полученных данных нами были разработаны «Методические наставления по дифференциальной диагностике Nosema apis и Nosema ceranae у медоносной пчелы ( Apis mellifera L .)», утвержденные 25 октября 2011 года отделением ветеринарии Россельхозакадемии [3].

В Тюменской области нозематоз регистрировали в течение длительного времени. В частности, в середине 70-х годов выявление нозематоза на пасеках в этом регионе проводил с.н.с. ВНИИВЭА Н.Г. Сидоров. В период с 2005 по 2010 гг. нами были исследованы пробы пчел с пасек Тюменской области на наличие возбудителей нозематоза. В результате проведённой работы было выявлено 76,5 % неблагополучных пасек из 106 обследованных. В 20% проб выявлена легкая степень поражения нозематозом, в таком же объеме зарегистрирована средняя степень и в 6% – сильная степень поражения пчелиных семей (Домацкая и др., 2010).

В 2012 году нами исследована 221 проба пчел от 34 пасек Тюменской области. В 40,8 % пробах пчёл с 22 пасек обнаружили возбудителей нозематоза. На 9 пасеках Тюменского, Аромашевского, Исетского, Вагайского районов выявили возбудителя Nosema apis , на 9 пасеках Тюменского, Заводоуковского, Ярковского районов обнаружили микроспоридии Nosema ceranae , на 4 пасеках Исетского, Тюменского и Нижнетавдинского районов зарегистрировали обоих возбудителей нозематоза пчёл.

На некоторых пасеках установили источники возникновения заболевания пчелиных семей. Например, пасека в п. Боровский была основана в 1985 году при завозе пчелопакетов из пасек Краснодарского края. С тех пор и до настоящего времени нозематоз регистрируется на пасеках в данном населенном пункте. На ст. Подъём образованию пасеки способствовала поимка роя с соседней пасеки в 1985 году, где ежегодно отмечают клинические признаки нозематоза у 10-20% семей. Пасеку в д.

Дубровное в 2008 году пополнили пчелопакетами из Пермского края [6], где впоследствии через три недели отмечали вспышку нозематоза в конце июня. До сих пор остается неясным вопрос, какая популяция возбудителя дала вспышку: местная или завезенная с пакетами. В д. Кулига в 2005 году пасеку восстановили пчелопакетами. В 2007 году в д. Кулига провели обследование пасеки и отбор проб пчел. В 54% проб от 24 пчелиных семей были обнаружены споры возбудителя нозематоза с разной степенью поражения пчёл.

Нами было проведено исследование проб пчел с пасек различных регионов России, результаты которых представлены в таблице 1. В результате проведенных исследований нами выявлено широкое распространение обоих возбудителей на пасеках России. При этом отмечено значительное количество пчелиных семей, пораженных нозематозом (49,9%), из них в 51,6% проб обнаружены Nosema apis , а в 48,4% – Nosema ceranae .

1. Распространение возбудителей нозематоза на пасеках России

Таким образом, проведенные нами исследования позволили выявить два вида возбудителя нозематоза пчел на пасеках России. В России в ветлабораториях проводят диагностику нозематоза методом световой микроскопии и при обнаружении Nosema-подобных спор патоген определяют как Nosema apis. Для понимания картины распространения обоих патогенов на территории России и связанной с ними опасности для пчеловодства необходимо продолжение исследований. В связи с этим, мы предлагаем заинтересованным пчеловодам отправлять нам пробы пчел для исследования распространения возбудителей нозематоза медоносных пчел на пасеках России.

Исследования поддержаны грантом РФФИ № 12-04-90727-моб_ст.

ЛИТЕРАТУРА:  1. Методические указания по лабораторным исследованиям на нозематоз медоносных пчёл. Утв. ГУВ МСХ СССР 25.04. 1985 г. – М., 1985. – 3 с. 2. Зинатуллина, З.Я. Методические наставления по дифференциальной диагностике Nosema apis и Nosema ceranae у медоносной пчелы (Apis mellifera L.) / З.Я. Зинатуллина, О.Н. Жигилева, Ю.С. Токарев и др. // Сб. науч. тр. ВНИИВЭА. – Вып.51. – Тюмень, 2011. – С. 286–300. 3. Зинатуллина, З.Я. «Азиатский» нозематоз в России / З.Я. Зинатуллина, А.Н. Игнатьева, О.Н. Жигилева, Ю.С. Токарев / Пчеловодство. – 2011. – № 10. – С. 24–26. 4. Домацкая, Т.Ф. Основные болезни медоносных пчел на пасеках Тюменской области (эпизоотология, диагностика, профилактика, меры борьбы) / Т.Ф. Домацкая, Н.М. Столбов, О.А. Модин и др. // Тюмень: ООО «Делс», 2010. – С. 31. 5. Cотников, А.Н. Причины гибели пчел / A.Н. Cотников, О.Ф. Гробов // Пчеловодство. – 2003. – №7. – C. 30–32. 6. Токарев, Ю.С. Молекулярная диагностика нозематоза / Ю.С. Токарев, А.Н. Игнатьева, З.Я. Зинатуллина // Пчеловодство. – 2010. –  № 10 – С. 18–19. 7. Цандер, Е. Болезни и вредители пчёл / Е. Цандер. – М.: Новая деревня, 1927. – С 30-40.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НОЗЕМАТОЗА ПЧЁЛ

Зинатуллина З.Я., Жигилева О.Н., Игнатьева А.Н., Токарев Ю.С.

Резюме

Применение методов молекулярной диагностики (амплификация и секвенирование рибосомальной ДНК)    позволило    провести дифференциальную диагностику возбудителей нозематоза - Nosema apis и Nosema ceranae. Результаты исследования свидетельствуют о том, что оба вида встречаются с одинаковой частотой в пчелиных семьях.

DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF BEES NOSEMATOSIS CAUSATIVE AGENT

Zinatullina Z.Ya., Zhigilyeva O.N., Ignatyeva A.N., Tokaryev Yu.S.