Дифференциальная диагностика злокачественных опухолей головного мозга

Введение. В настоящее время актуальным вопросом в медицине остается поиск потенциальных предикторов злокачественных опухолей головного мозга в жидких средах организма, таких как спинномозговая жидкость и кровь.

Для диагностики заболеваний в медицине используют биомаркеры — биологические индикаторы патологического процесса или фармакологического ответа на терапевтическое воздействие [1]. С их помощью определяется или подтверждается наличие заболевания, устанавливается подтип заболевания [2]. В кровь и ликвор поступает содержимое опухолей, продукты метаболизма злокачественных клеток, и их как количественное, так и качественное определение в данных жидкостях может выступать в роли диагностического критерия. Так, например, диагностическими биомаркерами глиом могут выступать микроРНК, внеклеточные нуклеиновые кислоты, белки и отдельные аминокислоты, циркулирующие клетки опухоли, экзосомы, микроэлементы и другие вещества [3].

Свободно-циркулирующие ДНК (сцДНК) — это низкомолекулярные двухцепочечные молекулы геномной ДНК, фрагментированные на короткие (70-200 пар оснований) и длинные (до 21 тыс. пар оснований) отрезки, устойчивые к РНКазам и проназам, но расщепляемые с помощью ДНКазы I [4; 5].

В настоящее время растет число исследований, посвященных анализу сцДНК плазмы крови, совершенствуются методы, позволяющие проводить их изучение, однако до сих пор недостаточно изучены механизмы высвобождения и циркуляции сцДНК, а также их биологическая роль в прогрессировании онкологии. Существенными недостатками в изучении сцДНК являются гетерогенность опухолевой ткани, отсутствие высокочувствительных методов анализа, а также малые выборки больных, включенных в программы клинических исследований.

По нашему мнению, инфракрасная спектроскопия является перспективным методом диагностики в этом направлении [6; 7]. Известны исследования авторов по изучению ИК-спектроскопии опухолевых тканей в диагностике опухолей головного мозга и в определении молекулярно-генетического профиля опухоли, в частности определение мутации изоцитратдегидроеназы (IDH). Авторами показано, что ИК-спектры опухолевых и неопухолевых тканей при разной онкопатологии, серого и белого вещества головного мозга, тканей астроцитом и глиобластом отличаются друг от друга [8; 9]. Всеми авторами отмечается высокая эффективность и чувствительность метода ИКС тканей в диагностике и дифференциальной диагностике опухолевых заболеваний [11; 12]. Имеются немногочис- ленные работы по применению инфракрасной спектроскопии сыворотки крови для дифференциальной диагностики ОГМ и определения их степени злокачественности [13–15].

Цель работы: качественное и количественное определение продуктов распада ДНК в сыворотке крови больных с разными видами злокачественных опухолей головного мозга.

Материалы и методы исследования. Исследование проводили в научноисследовательской лаборатории кафедры общей химии Приволжского исследовательского медицинского университета г. Нижнего Новгорода.

Исследовали венозную кровь больных со злокачественными опухолями головного мозга: анапластическая астроцитома (grade III) (n=5), анапластическая глиобластома (grade IV) (n=5) — пациенты находились на лечении в Университетской клинике ПИМУ, а также сыворотку крови здоровых добровольцев (n=5) (сотрудники ПИМУ). От пациентов было получено добровольное согласие.

Образец крови готовили следующим образом: кровь в количестве 5 мл забирали у обследуемых больных из кубитальной вены утром натощак до приема медикаментов. Затем ее центрифугировали в течение 15 мин при 1000 об/мин. Полученную сыворотку в объеме 1,0 мл высушивали в сухожаровом шкафу в чашке Петри при температуре 25 °С в течение 12 часов.

Для качественного определения компонентов циркулирующей ДНК в плазме крови проводили аналитические реакции по выявлению пуриновых оснований, дезоксирибозы и фосфорной кислоты в плазме крови.

Пуриновые основания определяли в качественной реакции с аммиачным раствором нитрата серебра. Для этого в пробирку добавляли 0,015 г сухой плазмы крови, 2 мл дистиллированной воды, 2 мл 10% NaOH и 10 капель 1%-ного раствора AgNO 3 . О наличии в исследуемых пробах пуриновых оснований судили по образованию осадка их серебряных солей, окрашенных в светлокоричневый цвет.

Дезоксирибозу и рибозу определяли в качественной реакции с дифениламином. К 0,015 г сухой плазмы крови добавляли 20 капель 1%-ного раствора дифениламина и кипятили на водяной бане в течение 15 минут.

О наличии в пробах дезоксирибозы судили по развитию синего окрашивания, имея в виду, что ее нагревание в кислой среде способствует образованию фурфурола, оксилевулинового альдегида и ряда других хромогенов, конденсирующихся с дифениламином и образующих соединения, имеющих синий цвет. В свою очередь, о наличии в пробах рибозы судили по развитию зеленого окрашивания.

Фосфорную кислоту определяли в молибденовой пробе. К 0,015 г сухой плазмы крови добавляли 10 капель молибденового реактива (раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте) и кипятили на водяной бане. Затем охлаждали пробирки под струей воды и наблюдали образование лимонножелтого осадка молибдатофосфата аммония.

В основе данной методики лежит реакция образования молибдатофосфата аммония при взаимодействии молибдата аммония с фосфорной кислотой:

Н 3 РО 4 +12(NH 4 ) 2 MoO 4 +21HNO 3 →(NH 4 ) 3 PO 4 •12MoO 3 +21NH 4 NO 3 +12Н 2 О

Количественное определение продуктов распада ДНК осуществляли с помощью физико-химического метода — ИК-спектроскопии. Высушенный образец сыворотки крови измельчали и перемешивали с растворителем — вазелиновым маслом. Регистрацию инфракрасных спектров производили на спектрофотометре Specord 75 IR в области волновых чисел 1200– 800 см-1 [16–18].

Результаты работы и их обсуждение. На первом этапе исследования проводили качественное определение содержания продуктов распада ДНК в сыворотке крови.

Сыворотку крови больных анапластической глиобластомой, анапластической астроцитомой и здоровых добровольцев взвешивали на электронных весах (0,015 г) и растворяли в дистиллированной воде (2 мл). Проводили качественные реакции определения компонентов циркулирующей ДНК в плазме крови по выявлению пуриновых оснований, дезоксирибозы и фосфорной кислоты в плазме крови. По появлению характерного окрашивания исследуемых растворов делали вывод о наличии всех перечисленных компонентов распада ДНК в сыворотке крови.

Таким образом, в ходе проведенных реакций нам удалось качественно обнаружить продукты распада в плазме крови — пуриновые азотистые основания, дезоксирибозу и фосфорную кислоту.

На втором этапе исследования методом ИК-спектроскопии количественно определяли изменение содержания пуриновых азотистых оснований в плазме крови при разной степени злокачественности. Для этого высушили осадки серебряных солей пуриновых оснований в плазме крови больных ЗОГМ анапластической глиобластомой, анапластической астроцитомой и здорового добровольца в чашках Петри, а затем проводили регистрацию ИК-спектров образцов нативной сыворотки и сыворотки с осадками в диапазоне длин волн 1200–800 см^- (рис. 1–3).

Рис. 1. ИК-спектр плазмы крови больного анапластической глиобластомой и плазмы с осадком

Рис. 2. ИК-спектр плазмы крови больного анапластической астроцитомой и плазмы с осадком

Рис. 3. ИК-спектр плазмы крови здорового добровольца и плазмы с осадком

Было выявлено усиление максимумов при полосах поглощения 940 и 878 см-1 ИК-спектра, которые на основании литературных данных и справочников являются полосами поглощения именно пуриновых азотистых оснований — гуанина и аденина.

Таким образом, используя простой метод визуализации, можно делать заключение о наличии и степени злокачественности опухоли мозга.

Далее рассчитали величину максимумов данных пиков. Для этого измерили расстояние в мм до касательной, проведенной по выступающим точкам спектра (табл. 1, 2).

Таблица 1 Изменение параметров ИК-спектров крови

Максимум, мм	940 см-1	878 см-1	940/878 cм-1
Глиобластома+осадок	28±1	36±3	0,78
Астроцитома+осадок	27±1	41±1	0,66
Норма+осадок	20±2	14 ±3	1,43

Как видно из таблицы 1, при глиобластоме частное от деления уменьшается на 45%, при астроцитоме — на 55%, что свидетельствует об уменьшении количества пуриновых оснований в плазме крови.

Таблица 2

Изменение параметров ИК-спектров крови

Максимум, мм	940 см-1	878 см-1	940/878 cм-1
Глиобластома	30±1	26±2	1,15
Астроцитомак	29±1	24±1	1,21
Норма	31±2	24 ±2	1,29

Как видно из таблицы 2, при глиобластоме частное от деления уменьшается на 11%, при астроцитоме — на 6 %, что коррелирует с данными по содержанию осадка и свидетельствует об уменьшении количества пуриновых оснований в плазме крови.

Заключение. Продукты распада ДНК, а именно пуриновые азотистые основания, дезоксирибоза и фосфорная кислота, имеют важное прогностическое значение. В ходе работы установили, что они присутствуют в плазме крови и у здоровых добровольцев и больных с ЗОГМ. Количественное определение содержания этих веществ методом ИК-спектроскопии показало снижение содержания пуриновых оснований, следовательно, и дезоксирибозы и фосфорной кислоты в растворе плазмы крови больных ЗОГМ. Визуализация ИК-спектров плазмы крови больных с глиобластомой и анапластической астроцитомой позволила дифференцировать эти опухоли между собой.