Динамика провирусной нагрузки и антителообразования при экспериментальной BLV-инфекции у крыс

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) является этиологическим фактором распространенной во всем мире хронической инфекции, возбудитель которой имеет склонность к расширению своего тропизма, как в отношении отдельных клеток и тканей, так и в отношении круга восприимчивых хозяев [5, 6]. При BLV-инфекции провирусная нагрузка и антителообразование являются основными диагностическими маркерами для определения прогрессирования заболевания и риска передачи инфекции, что имеет определенную корреляцию с генотипом выделенного от животных вируса [1]. Кроме того, недавно появившиеся штаммы BLV могут вызывать более раннее начало злокачественной пролиферации вирус трансформированных клеток, что сопровождается высокой провирусной нагрузкой в инфицированном организме и способствует повышенному риску передачи BLV интактным животным. При этом провирусная нагрузка коррелирует не только с инфекцией BLV, но и с прогрессированием заболевания, являясь важным показателем оценки стадии инфекции [7]. Основной иммуноген вируса, гликопротеид Gp51, индуцирующий образование вируснейтрализующих антител в зараженном организме, не только детерминирует цикл репродукции BLV, но так как служит основным фактором инфекционности вириона и прогностическим маркером динамики и стадийности заболевания [3].

Ранее проведенные исследования показали высокую восприимчивость белых крыс линии Wistar к инфекции BLV [2, 4]. Однако, несмотря на характерные для лейкозного процесса гематологические, иммунологические и цитологические изменения в организме лабораторных крыс при экспериментальной BLV -инфекции, вопрос изучения динамики инфекционного процесса у них является актуальным. Комплексное исследование антителообразования и провирусной нагрузки в зараженном организме в динамике могут охарактеризовать тип инфекции: абортивная, продуктивная, персистирующая, латентная или инаппарантная, что позволит достоверно судить о возможности использования белых лабораторных крыс в качестве лабораторной модели для изучения эффектов BLV in vivo и определения эффективности противовирусных превентивных и терапевтических препаратов, разработка которых является актуальной тенденцией современной вирусологии и лейкозологии.

В связи с выше сказанным, целью настоящих исследований стало изучение динамики провирусной нагрузки и антителообразования в организме белых лабораторных крыс линии Wistar при экспериментальной BLV -инфекции.

Материал и методы исследований. В качестве объекта исследования выступили 6-и месячные белые лабораторные крысы линии Wistar (n=12), которые были парентерально инфицированы лимфоцитами BLV-положительных коров по оригинальной авторской методике (патент РФ № 2615465). Животных содержали в стандартных клетках группами по 3 самки и 1 самцу на полноценном рационе при свободном доступе к воде, в соответствии с ГОСТом 33216-2014. Кровь отбирали из сердца крыс в пробирки для гематологических исследований (ЭДТА-К3) и пробирки с активатором образования кровяного сгустка (SiO2) четырехкратно в течение года с интервалом три месяца. Исследования крови и ее сыворотки проводили в день получения. Провирус в крови экспериментальных крыс определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, а динамику антителообразования изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для экстракции и очистки нуклеиновых кислот из крови экспериментальных животных применяли комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-B», а динамику провирусной нагрузки определяли с использованием тест-системы «ЛЕЙКОЗ» (ИнтерЛабСервис, Россия) на амплификаторе CFX 96 (BioRad, США).

Динамику антителообразования изучали с помощью набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота производства ООО «Ветбтохим» (Москва, Россия) на биохимическом и ИФА анализаторе автоматическом Chem Well 2910 (Awareness Technology, США).

Для изучения инфекционности адаптированного в организме крыс вируса, осуществляли перезаражение интактных крыс кровью инфицированных. Затем определяли у них динамику провирусной нагрузки и антителообразования. Кроме того, проводили аналогичные исследования потомства инфицированных крыс для установления возможности передачи возбудителя от родителей потомству горизонтальным и вертикальным путями.

Результат исследований. В результате проведенных исследований были определены титры антител у экспериментальных животных и провирусная нагрузка в динамике эксперимента, характеризующие тип инфекционного процесса, индуцированного у них путем парентерального введения BLV -инфицированных лимфоцитов крови. Полученные в ходе эксперимента данные представлены в таблицах 1-4.

Таблица 1 – Результаты ПЦР-скрининга экспериментальных крыс

№ образца	Цикл выхода кривой за пороговую линию
	3  месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции	9 месяцев после инфекции	12 месяцев после инфекции
1	30	26	25	27
2	16	16	13	12
3	11	11	17	13
4	22	20	10	9
5	15	14	19	18
6	15	18	12	7
7	15	19	30	31
8	11	17	15	5
9	33	28	24	14
10	21	11	9	6
11	21	27	32	33
12	13	16	13	8
К+	13	15	17	11
К-	-	-	-	-

Примечание: 1-12 – номер животных экспериментальной группы; К+ – положительный контроль ПЦР; К- – отрицательный контроль ПЦР

Как следует из представленных в таблице 1 данных, через 3 месяца после инфицирования по оригинальной авторской методике все крысы, в той или иной степени, были носителями провируса BLV. Крысы № 7 и 11 показали отрицательную динамику провирусной нагрузки, однако на окончание эксперимента полной элиминации возбудителя у них не было отмечено. У крысы № 1 провирусная нагрузка была не высокой и в динамике эксперимента не имела выраженной положительной тенденции. Остальные 9 экспериментальных животных проявили выраженную положительную тенденцию провирусной нагрузки в динамике эксперимента, что свидетельствует о развитии у них продуктивной BLV-инфекции.

Таблица 2 – Динамика антителообразования экспериментальных крыс

№ образца	Титр АТ в динамике эксперимента, EU
	3 месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции	9 месяцев после инфекции	12 месяцев после инфекции
1	51,9	42,2	49,2	30,4
2	95,4	64,1	52,7	89,2
3	86,1	80,9	87,6	92,4
4	65,1	70,4	55,2	78,5
5	62,9	64,1	78,5	90,3
6	74,7	66,2	72,9	81,3
7	45,9	57,2	60,8	72,2
8	71,1	57,9	81,1	85,4
9	44,4	38,1	54,6	74,4
10	91,7	73,7	94,4	89,5
11	57,2	73,5	84,1	91,7
12	49,7	36,7	63,6	71,4

Примечание: 1-12 – порядковый номер животных экспериментальной группы

Как следует из данных, представленных в таблице 2, титр АТ в сыворотке крови экспериментальных крыс варьировал в значительных пределах. При этом у большинства животных была отмечена волнообразная тенденция: на 6 месяц после заражения титр АТ несколько снижался, затем отмечалась положительная динамика антителообразования. Отрицательная динамика антителообразования была отмечена только у крысы №1, что, вероятно, обусловлено невысокой провирусной нагрузкой у данной особи в течение эксперимента.

Исследование инфекционности адаптированного в организме лабораторных животных возбудителя энзоотического лейкоза крупного рогатого скота осуществляли по двум направлениям. Во-первых, воспроизводя перезаражение интактных крыс кровью инфицированных, а, во-вторых, исследовали потомство инфицированных крыс с последующим определением у них динамики провирусной нагрузки и антителообразования. Как следует из данных таблицы 3, перезаражение интактных крыс кровью инфицированных животных имело положительный результат. В 50 % случаев динамика инфекции при этом имела выраженную положительную тенденцию. За 6 месяцев наблюдения в данной группе животных элиминации возбудителя не произошло, что является свидетельством инфекционности адаптированного в организме крыс BLV для животных этого вида. Динамика антителообразования интактных крыс при перезаражении их кровью инфицированных BLV животных в 50 % случаев была резко положительной, однако находилась в обратной корреляции с динамикой провирусной нагрузки у данных животных, что объясняется снижением титра АТ при высокой провирусной нагрузке, а также в силу того, что иммунная реакция, по данным ряда исследователей, при   BLV-инфекции развивается по типу торможения.

Таблица 3 – Динамика инфекционного процесса крыс при внутривидовой передаче BLV путем парентерального заражения

№ образца	Титр АТ в динамике эксперимента, EU		Цикл выхода кривой за пороговую линию
	3 месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции	3 месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции
1*	49,2	71,6	28	15
2*	95,1	79,2	5	15
3*	35,1	66,4	30	19
4*	83,6	69,1	8	21
К+	х	х	17	11
К-	х	х	-	-

Примечание: 1*-4* – интактные крысы, перезараженные кровью инфицированных животных; К+ – положительный контроль ПЦР; К- – отрицательный контроль ПЦР; х – исследования не проводились

Таблица 4 – Динамика инфекционного процесса крыс при внутривидовой передаче BLV от матерей потомству

№ образца	Титр АТ в динамике эксперимента, EU		Цикл выхода кривой за пороговую линию
	3 месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции	3 месяца после инфекции	6 месяцев после инфекции
М1	37,1	59,9	32	12
М2	35,2	65,1	24	19
М3	35,1	39,9	6	6
М4	43,6	63,4	22	16
Д1	47,2	59,8	23	14
Д2	35,6	55,3	20	8
Д3	39,4	51,2	30	21
Д4	33,8	56,7	27	17
К+	х	х	17	11
К-	х	х	-	-

Примечание: М1-4 – потомство экспериментальных крыс (самцы); Д1-4 – потомство экспериментальных крыс (самки); К+ – положительный контроль ПЦР; К- – отрицательный контроль ПЦР; х – исследования не проводились

Как свидетельствуют представленные в таблице 4 данные, рандомно выбранное потомство экспериментальных животных, содержавшееся совместно с родителями, также было инфицировано BLV, что может свидетельствовать, как о возможной трансплацентарной передаче вируса, так и о постнатальной инфекции молоком. Причем у всех без исключения животных динамика провирусной нагрузки была положительной в той или иной мере, что можно аргументировать снижением иммунного статуса потомства BLV-инфицированных животных, провоцирующим более злокачественное течение инфекционного процесса у них по сравнению с родительским поголовьем. Динамика антителообразования у потомства инфицированных крыс также была положительной. Только у одной особи, М3, она оставалась фактически на одном уровне, что коррелировало с высокой провирусной нагрузкой, вероятно, и послужившей тому причиной.

Заключение. Таким образом, результаты проведенных исследований выявили, что BLV-инфекция крыс характеризуется выраженной прогрессивной динамикой, элиминации возбудителя не происходит, животные проявляют ответную реакцию в виде антителообразования, что характеризует продуктивную BLV инфекцию у них. Следовательно, белые лабораторные крысы линии Wistar могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении эффектов возбудителя лейкоза крупного рогатого скота in vivo. При этом пассаж в организме лабораторных крыс не приводит к снижению инфекционности BLV для лабораторных животных, а у потомства зараженных крыс отмечается более агрессивное развитие инфекционного процесса, чем у их родителей.

Резюме

Изучена динамика антителообразования и провирусной нагрузки при экспериментальной BLV -инфекции лабораторных крыс. Установлено, что при парентеральном заражении BLV у крыс линии Wistar развивается продуктивная инфекция, элиминации возбудителя не происходит, животные проявляют ответную реакцию в виде антителообразования. Следовательно, белые лабораторные крысы линии Wistar могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении эффектов возбудителя лейкоза крупного рогатого скота in vivo. При этом пассаж в организме лабораторных крыс не приводит к снижению инфекционности BLV для лабораторных животных, а у потомства зараженных крыс отмечается более агрессивное развитие инфекционного процесса, чем у их родителей.