Динамика развития пневмонии у мышей дикого типа и мышей, лишённых гена сурфактантного белка А (SP-A), после ингаляции озона

Алексеева Наталия Ивановна, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры общей гигиены и экологии

Иванченко Маргарита Николаевна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры общей гигиены и экологии

негативный эффект озона, так и иммунный статус лёгких, в свою очередь, подвержены влиянию половой принадлежности. Известно, что представители мужского пола более чувствительны к заболеваниям лёгких, чем представители женского пола [3-5]. Более того, недавно мы показали на экспериментальных моделях, что, несмотря на то, что самки мышей были изначально более устойчивы к пневмонии, чем самцы, после ингаляции озона тренд менялся на противоположный и самки становились более чувствительными к пневмонии, чем самцы [6]. Таким образом, изначальное преимущество самок перед самцами в отношении смертности от лёгочной инфекции элиминировалось и оказывалось фактором риска в случае ингаляции озона перед заражением пневмонией.

Сурфактантный белок А (SP-A, Surfactant Protein A) выполняет защитную функцию в лёгких, в частности, повышая фагоцитоз бактерий. Ранее мы показали, что окисление SP-A озоном in vitro приводит к снижению его про-фагоцитарной активности [7, 8]. Кроме того, блокирование функции SP-A путём элиминации гена SP-A в генетически модифицированных SP-A (-/-) мышах или путём снижения функциональной активности белка SP-A вследствие его окисления озоном повышает чувствительность мышей к экспериментальной пневмонии после ингаляции озона, и в обоих случаях самки более подвержены негативному влиянию озона, чем самцы [6, 9].

Поскольку исход лёгочного заболевания критически зависит от событий, происходящих в организме на начальных стадиях инфекции, в данной работе мы изучили развитие пневмонии в течение первых двух дней постинфекции у самок и самцов мышей дикого типа и SP-A (-/-) мышей, чтобы определить различия в динамике заболевания у мышей обоих типов и полов в присутствие и отсутствие окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона.

Методы исследования. Самцы и самки мышей дикого типа линии С57BL/6 и изогенных SP-A (-/-) мышей (в возрасте 8-12 недель), лишённые гена SP-A, были разделены на 2 группы по 5 мышей: одна группа была подвергнута ингаляции озона (в дозе 2 ppm в течение 3 часов), а другая – ингаляции фильтрованного воздуха (контроль). Затем все мыши были инфицированы пневмонией, как описано ранее [6]. Всего было проведено 3 или 4 независимых эксперимента для каждого пола (5

животных после ингаляции воздуха и 5 – после ингаляции озона в каждом эксперименте). Бактерии K. pneumonia (ATCC 43816) были выращены на питательном бульоне TSB и бактериальная суспензия для заражения была приготовлена в PBS. После ингаляции озона или воздуха, мыши были внутритрахеально инфицированы полученной бактериальной суспензией в дозе 450 КОЕ/мышь. Количество бактерий в лёгких, крови и селезёнке после 12, 24 и 48 часов пост-инфекции было устоновлено путём подсчёта КОЕ. Для этого лёгкие или селезёнка от каждого животного были гомогенизированы в PBS. Затем гомогенат лёгких или селезёнки, а также образцы цельной крови были серийно разведены 1:10 в PBS и аликвоты из приготовленных разведений были нанесены на плотную питательную среду TSA для подсчёта выросших колоний. Кроме того, вес лёгких и селезёнки были также анализированы. Статистическую обработку данных проводили с по-мошью t-теста. Результаты были признаны статистически достоверными в случае, если p <0,05.

12 ч пост-инфекции мыши ДТ SP -A(-/-) мыш и

24 ч пост-инфекции 48 ч пост-инфекции мыши ДТ SP -A(-/-) мыш и мыши ДТ SP- A (-/-) мыш и

Рис. 1. Колониеобразующие единицы, подсчитанные в гомогенатах лёгких, селезёнки и в крови у мышей после ингаляции воздуха или озона и последующей пневмонии.

Мыши дикого типа (ДТ) и SP-A (-/-) мыши обоих полов были обработаны озоном (чёрные столбики) или воздухом (белые столбики, контроль) перед инфицированием. КОЕ рассчитывали на 20 мкл цельного гомогената лёгких или селезёнки, или цельной крови (т.е., до серийного разведения). “O₃”, “П”, и «ДТ-SP-A (-/-): эффект озона, пола, и SP-A, соответственно. Для статистических целей, сравнивались данные, трансформированные в log 10 , используя t-тест (или Mann-Whitney Rank Sum тест, *). Различия были признаны достоверными, в случае p < 0.05 (показаны скобами).

Результаты и обсуждение. В ходе исследования схожая закономерность была обнаружена для мышей дикого типа и для SP-A (-/-) мышей. У обоих типов мышей было выявлено: 1) ингаляция озона приводила к снижению способности животных уничтожать патогенные бактерии в лёгких, при этом лёгкие самок были подвержены колонизации бактериями K. pneumoniae в большей степени, чем лёгкие самцов (рис. 1); 2) в отсутствии обработки озоном, самцы были подвержены более высокому уровню диссеминации инфекции в кровь и селезёнку, чем самки (рис. 1); 3) после ингаляции озона и последующей пневмонии наблюдался противоположный тренд относительно веса лёгких и селезёнки у обоих полов: вес лёгких повышался, а весь селезёнки понижался, и в обоих случаях изменения были более выраженными у самок по сравнению с самцами (рис. 2).

Таким образом, данные показали, что сниженная способность мышей уничтожать бактерии в лёгких (количество КОЕ значительно возрастало в ходе инфекции) и неэффективный иммунный ответ в селезёнке (отсутствие способности селезёнки повышать вес в ответ на прогрессирование и генерализацию инфекции) могут быть среди факторов, вносящих значительный вклад в более низкую выживаемость самок по сравнению с самцами после пневмонии в условиях ингаляции озона. Однако повышенная диссеминация бактерий из лёгких в кровь и селезёнку может являться одним из значимых факторов, обусловливающих более низкий уровень выживанию самцов по сравнению с самками после пневмонии в отсутствии ингаляции озона. Данное исследование свидетельствует о том, что существуют половые различия в динамике пневмонии после ингаляции воздуха или озона в течение первых двух дней пост-инфекции.

Время пост-инфекции

Рис. 2. Вес лёгких и селезёнки у мышей после ингаляции воздухом или озоном и последующей пневмонии.

Дизайн эксперимента описан в подписи к рис. 1. Пунктирными линиями обозначены данные, полученные от мышей после ингаляции воздуха, а сплошными линиями – после ингаляции озона. Самцы и самки обозначены квадратами и кружками на линиях, соответственно. “O 3 ”, “П”: эффект озона или пола, соответственно. Достоверные различия между мышами дикого типа и SP-A (-/-) мышами показаны в панелях для SP-A (-/-) мышей. Данные сравнивались с помощью t-тест (или Mann-Whitney Rank Sum тест, *). Различия были признаны достоверными, в случае p < 0.05 (показаны скобами).