Динамика состава микробиоты эндометрия коров на фоне применения биологической кормовой добавки

Введение. Инфекционные факторы, влияющие на репродуктивную способность коров, в первую очередь связаны с микробной колонизацией, которая может привести к воспалительным процессам матки и ухудшению воспроизводства. Здоровье коров, включая репродуктивное, во многом определяется симбиозом с микробиотой в рубце и кишечнике [1]. Однако в последние годы для реализации потенциала производства молока используются высокоэнергетические рационы, которые отрицательно влияют на микробиоту пищеварительного тракта, усугубляют процесс колонизации патогенных микроорганизмов [1]. Нарушения микробиома кишечника млекопитающих, включая человека, связаны с некоторыми заболеваниями репродуктивной системы [2]. Установлено, что дисбактериоз и, как следствие, нарушения микробиома репродуктивной системы могут приводить к снижению фертильности у коров. Так, например, изменения в микробиоте рубца и кишечника могут нарушать нормальную абсорбцию витаминов и минералов, которые играют ключевую роль в репродуктивных процессах. Дефицит определенных нутриентов может вызывать аменорею, яловость и другие проблемы, связанные с циклом размножения.

В транзитный период (период между тремя неделями до и тремя неделями после отела) метаболическая адаптация коров к резкому увеличению потребностей в энергии и питательных веществах, как правило, происходит особенно тяжело [3]. В это время коровы начинают готовиться к лактации при одновременном стремительном росте эмбриона, что приводит к резкому увеличению потребностей в энергии и питательных элементах. Неправильное или недостаточное кормление в этот критический период может привести к серьезным метаболическим нарушениям и заболеваниям. Снижение потребления корма, нарушение пищеварительных процессов и, как следствие, недостаток питательных веществ могут привести к клиническим заболеваниям, в частности гинекологическим. Кетоз, который возникает из-за недостатка углеводов и переизбытка жиров в рационе, приводит к снижению аппетита и недостаточному питанию, что может прямо повлиять на репродуктивную функцию. Снижение уровня прогестерона из-за дисфункции яичников может стать причиной проблем с регулярностью циклов, нарушения овуляции и других гинекологических заболеваний. Одним из наиболее распростра- ненных является метрит - воспаление матки, которое может развиться после отела, когда иммунная система коровы находится в ослабленном состоянии.

Современные исследования показывают, что восстановление и поддержание здорового микробиома может служить ключевым фактором в оптимизации репродуктивной функции. Учитывая важность транзитного периода для здоровья и продуктивности коров, особое внимание должно уделяться составлению сбалансированного рациона, который будет удовлетворять возросшие потребности. Важно не только обеспечивать коров сбалансированным кормом, но и включать в рацион пробиотики и пребиотики, которые могут способствовать восстановлению нормальной микробиоты. Пробиотики, содержащие живые микроорганизмы, могут улучшить пищеварение и снизить уровень патогенных бактерий, что, в свою очередь, может положительно сказаться на здоровье и показателях фертильности. Обычно пробиотики - это полезные бактерии, такие как лактобактерии, бифидобактерии и бациллы, которые могут улучшать баланс микробиоты. Предыдущие исследования показали положительное влияние пробиотиков на гинекологическое здоровье у людей и животных [4]. Применение пробиотиков, включая пероральные, опосредованно модулирующие состав микробиоты матки через регуляцию микробиома кишечника, было предложено в качестве терапевтического подхода для профилактики различных заболеваний репродуктивной системы [5]. Это позволит учитывать и экологическую составляющую ведения животноводства в условиях современных вызовов. Интенсификация производства часто приводит к проблемам, связанным с экологическими рисками, такими как загрязнение химическими пестицидами, агрохимикатами и лекарственными компонентами организма животных и продукции животноводства. Все это может способствовать ухудшению состояния здоровья человека и животных. Следовательно, устойчивая система управления, сосредоточенная не только на производственных показателях, но и на «зеленых» технологиях, становится все более актуальной.

В результате более глубокое понимание роли микробиоты в экологическом равновесии и коррекции ее при помощи пробиотиков может привести не только к улучшению здоровья коров и повышению продуктивности, но и к устойчивому развитию всей отрасли скотоводства.

Цель исследования – изучение влияния кормовой добавки «АнтиКлос®», которую вводили в состав рациона в транзитный период лактации, на состав микробиоты эндометрия высокопродуктивных коров голштинской породы и показатели воспроизводства коров.

Задачи: постановка научно-хозяйственного эксперимента на поголовье молочных коров по скармливанию натуральной кормовой добавки «АнтиКлос®» (ООО «БИОТРОФ», Россия); проведение анализа состава микробиоты эндометрия методом количественной ПЦР, анализа ряда показателей воспроизводства на фоне добавки и без нее.

Объекты и методы. Опыт проводили в животноводческом хозяйстве Ленинградской области на коровах голштинской породы 2–3-й лактации. Живая масса коров – 700 кг, среднесуточный надой за предыдущую лактацию – 45 кг. Животные пребывали в максимально идентичных условиях, содержание коров – беспривязное. Животные были поделены на 2 аналоговые группы (n = 20): контрольная группа I – основной рацион (ОР), опытная группа II – ОР с добавлением пробиотического биопрепарата «АнтиКлос®» (ООО «БИОТРОФ», Россия). «АнтиКлос®» включает штамм бактерии Bacillus sp., органические кислоты и комплекс веществ растительного происхождения. «АнтиКлос®» вводили в состав полносмешанного рациона опытной группы II из расчета по 50 г/гол/сут в транзитный период – за 21 день до отела (сухостой), затем 21 после отела – в новотельный период. Состав микроорганизмов эндометрия анализировали у трех клинически здоровых коров из контрольной группы I и опытной группы II. Проводили отбор проб соскобов с эндометрия в динамике – до начала эксперимента (22 дня до отела), непосредственно после отела и на 21-й день после отела. Суммарную ДНК выделяли с помощью кита FastDNA Spin Kit for Feces, (MP Biomedicals, Китай). Состав бактерий анализировали методом qRT-PCR на термоциклере ДТ Lite-4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) и c помощью набора «ПЦР-комплект» для ПЦР в реальном времени (ЗАО «Синтол», Россия) и праймеров (5'-3') (табл. 1). Показатели воспроизводства оценивали с помощью системы AfiMilk (Afimilk Ltd, США). Математическую и статистическую обработку результатов проводили методом многофакторного дисперсионного анализа в программах MS Excel, R- Studio (Version 1.1.453).

Таблица 1

Группа бактерий	Праймеры (5'-3')
1	2
Общее количество бактерий	HDA1:ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG HDA2:GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA
Lactobacillus sp.	Lac1:AGC AGT AGG GAA TCT TCC A Lab667r:CAC CGC TAC ACA TGG AG
Megasphaera sp., Veillonella sp. и Dialister sр.	Mega-142F GATGGGGACAACAGCTGGA Mega-X GACTCTGTTTTTGGGG
Streptococcus sp.	SE16S F AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGTCGAGCGAACAGACGA SE16S R TGTCACCGGCAGTCAACTTA
Lachnobacterium sp. и Clostridium sp.	P930 GTGAAATGCGTAGAGATTAGGAA P932 GATYYGCGATTACTAGYAACTC
Atopobium sp.	10f AGTTTGATCCTGGCTCAG 534r ATTACCGCGGCTGCTGG
Staphylococcus sp.	TstaG422:GGC CGT GTT GAA CGT GGT CAA ATC TstaG765:TIA CCA TTT CAG TAC CTT CTG GTA A
Сем. Fusobacteriaceae	Fs619F CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT Fs719R TGGTCCTCACTGATTCACACAGA
Сем. Enterobacteriaceae	Enterobac-F:CAT TGA CGT TAC CCG CAG AAG AAG C Enterobac-R:CTC TAC GAG ACT CAA GCT TGC

Окончание табл. 1

1	2
Prevotella sp. и Porphyromonas sp.	BacPre GAGTACGCCGGCAACGGTGA rBacPre TCACCGTTGCCGGCGTACTC
Mobiluncus sp. и Corynebacterium sp.	C240F GGAAGGAYGCATCTTGGCAGTCT C445R CATYGGGAARTCRCCGATGA

Продолжительность сервис-периода и индекс осеменения

Duration of the service period and insemination index

Продолжительность сервис-периода определяли по датам отела и плодотворного осеменения. Индекс осеменения вычисляли делением общего числа осеменений по стаду на количество беременностей.

Результаты и их обсуждение. Продемонстрировано, что в обеих группах наблюдались сходные изменения в численности некоторых групп эндометриальных микроорганизмов в динамике (табл. 2). Сразу после отела в обеих группах на порядок снижалось общее количество бактерий по сравнению с результатом, полученным при отборе проб за 22 дня до отела (Р ≤ 0,001). Также в обеих группах в этот период полностью нивелировались из сообщества такие таксоны микроорганизмов, как Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Mobiluncus sp. и Coryne-bacterium sp., среди которых часто встречаются патогенные и оппортунистические формы. На разных физиологических этапах жизненного цикла самки, включая периоды стресса и лактации, наблюдаются изменения в гормональном фоне, которые непосредственно сказываются на составе микробиоты эндометрия. Сдвиги в эндометриальных микробных сообществах могут быть связаны с изменениями в гормональном фоне на разных физиологических фазах [6]. Ранее было детектировано снижение числен- ности бактерий на фоне более высоких уровней прогестерона. Известно, что повышение уровня эстрогена стимулирует выработку и накопление гликогена, важного для питания многих микроорганизмов, тогда как высокий уровень прогестерона подавляет синтез гликогена [7], что может по-разному отражаться на численности микроорганизмов из различных групп. В фазе эстрогенового преобладания, которая предшествует овуляции, происходит выработка гормонов, способствующих увеличению проницаемости сосудов и усилению кровоснабжения, что может способствовать изменению условий среды для микроорганизмов. В эту фазу может наблюдаться увеличение разнообразия определенных видов бактерий, которые помогают подготовить эндометрий к возможной имплантации. С другой стороны, известно, что в фазе прогестеронового доминирования, когда уровень прогестерона значительно возрастает, наблюдается подавление некоторых патогенных микроорганизмов, что способствует созданию более благоприятной среды для поддержания беременности. Однако если гормональный фон нарушен, это может привести к дисбалансу в микробиомах и, как следствие, к развитию различных заболеваний, таких как эндометрит, который имеет негативное влияние на фертильность [8].

Таблица 2

Группа бактерий	Контрольная группа I (n = 3)			Опытная группа II (n = 3)
	22 дня до отела	Сразу после отела	21 день после отела	22 дня до отела	Сразу после отела	21 день после отела
1	2	3	4	5	6	7
Общее количество бактерий	2,0·105±1, 9·104	2,0·104± 1,2·103	2,0·105± 1,4·104	1,8·105± 1,5·104	2,4·104± 1,7·103*	2,2·105± 1,1·104
Lactobacillus sp.	<п.д.о.**	< п.д.о.	< п.д.о.	< п.д.о.	< п.д.о.	2,2·103± 1,2·102
Megasphaera sp., Veillonella sp. и Dialister sр.	4,0·103± 2,4·102	< п.д.о.	2,0·103± 1,3·102	6,2·103± 3,2·102*	< п.д.о.	2,1·103± 1,1·102

Окончание табл. 2

1	2	3	4	5	6	7
Streptococcus sp.	1,6·103± 75	< п.д.о.	1,0·103± 84	1,9·103± 79	< п.д.о.	1,2·103± 69
Lachnobacterium sp.	3,2·104±	5,0·103±	2,0·104±	3,0·104±	6,2·103±	9,3·104±
и Clostridium sp.	1,9·103	3,2·102	1,5·103	1,4·103	4,3·102	2,9·103*
Atopobium sp.	6,3	< п.д.о.	< п.д.о.	< п.д.о.	< п.д.о.	9,8
Staphylococcus sp.	1,6·103± 9,3·102	< п.д.о.	< п.д.о.	2,4·104± 1,7·103***	< п.д.о.	< п.д.о.
Сем. Fusobacteriaceae	< п.д.о.	< п.д.о.	2,5·104± 1,3·103	< п.д.о.	< п.д.о.	4,2·103± 1,1·102***
Сем. Enterobacteriaceae	4,0·103±	4,0·103±	6,3·104±	4,2·103±	2,4·103±	6,0·104±
	2,4·102	1,8·102	3,2·103	2,9·103	2,2·102*	3,1·103
Prevotella sp.	3,2·104±	1,0·104±	1,6·105±	5,5·104±	1,5·104±	2,2·104±
и Porphyromonas sp.	1,8·103	5,5·102	9,1·103	2,9·103*	9,4·102*	1,6·103****
Mobiluncus sp. и Corynebacterium sp.	3,2·103± 2,1·102	< п.д.о.	1,0·103± 71	2,8·103± 1,7·102*	< п.д.о.	< п.д.о.

Примечание: ** < п.д.о. – предел достоверного определения; *Р ≤ 0,05; ***Р ≤ 0,01; ****Р ≤ 0,001.

Содержание микроорганизмов в эндометрии коров, геномов/г The content of microorganisms in the endometrium of cows, genomes/g

На 21-й день после отела в контрольной группе I и опытной группе II по сравнению с результатом, полученным при отборе проб до отела, было отмечено увеличение в 15,7 и 14,3 раза соответственно численности представителей семейства Enterobacteriaceae , среди которых часто встречаются токсинопродуцирующие штаммы (Р ≤ 0,05). Заболевания, вызванные лекарственно-устойчивыми энтеробактериями, стали серьезной угрозой во всем мире. В частности устойчивость к бета-лактамным антибиотикам является серьезной проблемой в медицинском и ветеринарном секторах. Основным механизмом устойчивости является продукция лактамаз расширенного спектра действия (ESBL), которые могут гидролизовать пенициллин, цефалоспорины широкого спектра действия и монобактамы. Энтеробактерии, продуцирующие ESBL, не ограничиваются людьми, они также были найдены у животных.

Кроме того, в нашем эксперименте в этот период отмечено также появление в контрольной группе I бактерий семейства Fusobacteria-ceaе и в более низком количестве (в 6,0 раз ниже, чем в контроле, Р ≤ 0,01), – в опытной группе II. В период после отела, вследствие травм репродуктивных органов, численность патогенов в тканях эндометрия может увеличиться. Иногда нормальный баланс микроорганизмов в матке может восстановиться в течение 4–5 недель после отела. Однако нежелательные бактерии могут стойко колонизировать репродук- тивный тракт и приводить к воспалению. В случае нарушения целостности эндометрия репродуктивных органов коров могут создаться неблагоприятные условия для транспорта сперматозоидов и эмбрионального развития. На 21-й день после отела в контрольной группе I происходило возрастание на порядок содержания бактерий Prevotella sp. и Porphyromonas sp. по сравнению с данными, полученными при отборе проб до отела (Р ≤ 0,001). Тогда как на фоне кормовой добавки «АнтиКлос®» подобных изменений отмечено не было. Известно, что увеличение численности Fusobacteriaceaе и Entero-bacteriaceae, а также Prevotella sp. и Porphyro-monas sp. в эндометрии коров может явиться причинами патологии эндометрия – метрита, эндометрита и яловости [9]. Чрезмерный их рост на ранних стадиях эмбрионального развития увеличивает риск ранней эмбриональной смертности, аборта. Традиционно доминирующие в репродуктивной системе человека и приматов Lactobacillus sp. были найдены нами лишь в пробах, отобранных на 21-й день после отела, в опытной группе II (в небольшом количестве – (2,2 · 103 ± 1,2 · 102) геномов/г). В остальных пробах данные бактерии не обнаруживались. Ранее также показано, что репродуктивный тракт коров имеет иной микробный состав по сравнению с женским [10]. Например, у женщин во влагалище в норме доминируют Lactobacillus, защищая слизистую оболочку, предотвращая адгезию патогенов посредством эффекта конкуренции. В таких симбиотических отношениях Lactobacillus используют секретируемые половыми путями метаболиты, такие как углеводы муцина, в качестве источника питания. В свою очередь, лактобактерии секретируют иммуноактивные молекулы, такие как молочная кислота, бактериоцины и перекись водорода, которые предотвращают размножение патогенов. Тем не менее в конце эксперимента на фоне кормовой добавки увеличивалась численность группы Lachnobacterium sp. и Clostridium sp. (Р ≤ 0,05). Данные бактерии могут относиться к нормобиоте в репродуктивной системе коров, поскольку синтезируют летучие жирные кислоты, что может регулировать гомес-тостаз.

Репродуктивная эффективность является основной проблемой современной молочной промышленности во всем мире, определяя прибыльность молочной фермы. Низкая репродуктивная эффективность является одной из наиболее распространенных причин выбраковки молочных коров из стад. Она влияет на количество молока, производимого коровой в сутки, на продолжительность жизни коровы в стаде и косвенно влияет на затраты на замену стада, разведение и ветеринарное лечение. В нашем эксперименте анализ показателей, взаимосвязанных с воспроизводительными способностями телок, подтвердил полученные нами данные: сервис-период в контроле был на 8 дней больше, чем при использовании биопрепарата «АнтиКлос», улучшился и индекс осеменения (табл. 3).

Таблица 3

Показатель	Группа коров (n = 20)	x ̅ ±m	σ	C v , %	lim
Сервис-период	I	133±15,39	63,48	47,7%	76…241
	II	125±10,31	43,75	34,9%	76…203
Индекс осеменения	I	2,2±0,26	1,18	55,0%	1…4
	II	1,9±0,21	0,93	49,4%	1…4

Продолжительность сервис-периода и индекс осеменения

Duration of the service period and insemination index

Действительно, микробиом половых путей коров оказывает глубокое влияние на здоровье эндометрия, его гомеостаз и фертильность [11]. Показано, что феромоны, играющие жизненно важную роль в спаривании, частично продуцируются вагинальным микробиомом животных разных видов, включая коров [12]. С другой стороны, при наличии в нужном количестве в репродуктивной системе бактерий рода Lactobacillus снижается рН влагалища, что способствует улучшению репродуктивной функции путем подавления патогенов и улучшения качества ооцитов [11]. Здоровая микробиота, поддерживаемая метаболитами лактобактерий, помогает регулировать воспалительные процессы, что также позволяет создать оптимальные условия для имплантации эмбриона. Таким образом, наличие этих бактерий в нужных количествах не только защищает репродуктивную систему от инфекций, но и способствует более успешному протеканию всех этапов, связанных с размножением.

Заключение. Применение кормовой добавки «АнтиКлос®» улучшило эндометриальный микробиом коров, что способствовало последующему сокращению сервис-периода и снижению показателя индекса осеменения. Биологически активные вещества, вырабатываемые микробиотой кишечника, влияют на гормональные реакции организма через ось кишечник – мозг, что приводит к изменению гормонального профиля [12]. Это влияет не только на разнообразие и функции микробиома в пищеварительном тракте, но может оказать потенциальное влияние на микробиомы других участков тела, таких как матка, молочные железы. С другой стороны, тесная анатомическая близость между двумя биотопами (репродуктивная и пищеварительная системы) может способствовать колонизации кишечника микроорганизмами микробного сообщества репродуктивного тракта. Это предположение требует проведения дополнительных исследований.

Для успешного внедрения новых решений в области молочного скотоводства необходимо сформировать понимание в управлении кормлением и условиями содержания, которые могут оказывать существенное влияние на микробиоту и, соответственно, на здоровье и продуктивность поголовья животных. Это требует совместных усилий ученых и практиков в разработке подходов, которые будут способствовать улучшению здоровья и продуктивности поголовья. Также стоит отметить важность мониторинга состояния эндометриального микробиома животных в транзитный период. Регулярные анализы могут помочь своевременно выявить отклонения в состоянии коров и провести необходимые меры, что способно значительно снизить риски развития осложнений. Таким образом, обеспечение надлежащей поддержки и диагностики микробиома матки в транзитный период является ключевым для сохранения здоровья, повышения фертильности и продуктивности коров.