Динамика уровня фибриногена в крови рыб под влиянием стресса

Актуальность

Данные исследования важны как в современной ветеринарии, относительно недавно перешедшей на новую ступень развития, – хирургии декоративных рыб, так и в промышленном рыбоводстве, заинтересованном в продолжительном сохранении жизни самых продуктивных животных. В связи с этим, актуальна альтернативная оценка состояния здоровья промысловых рыб по показателям системы гемостаза и предотвращение их смертности в промышленных и декоративных условиях [1, 2].

В качестве стресс-факторов у рыб выступают абиотические факторы внешней среды, факторы внутренней среды, социальные факторы, антропогенные факторы. Стресс-реакции у рыб вызываются в основном катехоламинами и кортизолом, которые действуют в течение двух различных, но соприкасающихся друг с другом отрезков времени [2]. Количественная характеристика кортикального ответа рыб остается недостаточно изученной.

Существует обширная база зарубежных исследований, касающихся влияния различных видов стресса на промысловых и диких рыб [3, 4, 5, 6, 7, 8], у большинства из которых было экспериментально зафиксировано изменение концентрации кортизола в плазме крови. Среди этих работ можно отметить эксперимент по воздействию на сазане C. carpio десяти различных видов загрязнителей в сублетальных концентрациях, в результате чего концентрация глюкозы и кортизола сыворотки крови быстро повышались [9]. Напротив, уровень кортизола, глюкозы и некоторых других гематологических показателей значительно не изменились в результате транспортировки обыкновенного карпа C. carpio, причем отмечено, что предшествующие ей манипуляции оказались гораздо более существенным стрессовым фактором [10]. Стоит также отметить исследования, в результате которых была отмечена активация гемостатических механизмов у рыбы при стрессе, включающая быстрое снижение времени свертывания крови с увеличением числа тромбоцитов. Из других источников известно, что стресс, воспроизводимый путем вылова и манипуляций, понижает уровень фибриногена в крови вместе с увеличением числа тромбоцитов. Такие результаты, по мнению исследователей, подтверждают, что время свертывания является хорошим индикатором стресса, а его уменьшение возможно из-за увеличения числа тромбоцитов крови, вызванного повышением уровня катехоламинов и кортизола, которые выделяются во время стресса [11].

Русскоязычные работы с оценкой кортизола крови рыб под влиянием стресса весьма немногочисленны, лишь в недавнем исследовании по воздействию гипоксического стресса на C. carpio, прослеживалось изменение уровня кортизола в соответствии со стадиями классического адаптационного синдрома [3].

В доступной отечественной литературе можно встретить утверждение, что у рыб время свертывания крови ‒ довольно нестабильный показатель, который зависит не только от способа взятия крови, но и от факторов внешней среды, физиологического состояния рыбы [12].

Материалы и методы

Исследование проведено на кафедре ВНБ, хирургии и акушерства факультета ветеринарной медицины и биотехнологий Вологодской ГМХА имени Н. В. Верещагина. Для проведения эксперимента использовали 8 карпов (Cyprinus carpio).

В качестве комплексного стресс-фактора выступили манипуляции по забору крови у рыб, сопровождаемые тотальной гипоксией, а также дальнейшее перекрытие поступления растворенного кислорода в воду в течение следующих дней эксперимента [3]. Забор крови проводился шприцем из хвостовой артерии для исследования уровня фибриногена ‒ в пластиковые пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 1:9 [1], для анализа стресс-маркеров – в пластиковые пробирки без антикоагулянта. Взятие крови согласно методике проведения острого эксперимента для рыб осуществлялось немедленно после акклиматизации и далее через 24, 48, 72 и 96 часов после влияния стресс-фактора. Исследование крови проводили не позднее двух часов после ее забора.

Концентрацию кортизола в плазме крови устанавливали методом твердофазнового хемилюминесцентного иммуноанализа. Количественный анализ фибриногена определяли с помощью коагулометра «Thrombostat» производства Behnk Elektronik (Германия) [13].

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью програмного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 6.0. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m).

Достоверность различий показателей фибриногена и кортизола карпов с помощью критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Результаты исследования со значением вероятности допущения альфа-ошибки, равные либо менее 5% (р < 0,05), расценивались как статистически значимые. Различие двух показателей считали достоверным, если оно равнялось или превышало свою среднюю ошибку разности в два и более раз.

Качественную интерпретацию силы связи между стресс-реакциями и показателями коагулограммы выполняли по полученному значению R на основе шкалы Чеддока.

Результаты исследований

В целях оценки стрессорной реакции карпов при снижении уровня кислорода в воде были определены два показателя (стресс-маркера): кортизол и гемоглобин.

В результате проведенного эксперимента было отмечено, что уровень кортизола плазмы на 1-й и 3-й дни после воздействия стресс-факторов достоверно отличается от 2-го дня, а к 4-му дню уровень кортизола заметно снизился (табл. 1) . Данные изменения можно сопоставить с классической стадийностью стресса, в которой 1-й и 2-й дни эксперимента соответствуют первой стадии (тревоги), в 3-й день при значительном увеличении уровня кортизола плазмы проявляется стадия резистентности, а резкое его снижение к 4-му дню согласуется со стадией истощения, когда компенсаторные процессы организма исчерпаны, а полезноприспособительный эффект не достигнут [3].

Таблица 1 ‒ Динамика уровня кортизола и гемоглобина крови рыб в ходе эксперимента (с первого по четвертый дни)

Показатель	1 день, n=8	2 день, n=8	3 день, n=8	4 день, n=8
Кортизол, нг/мл	287,2±28,9**	118,9±56,6* ***	333,6±65,2**	211,8±112,2
Гемоглобин, г/л	89,1±2,12** ****	80,3±9,8* ****		52,9±1,9* **
* – различия достоверны с первым днем исследований (p≤0,05) ** – различия достоверны со вторым днем исследований (p≤0,05) *** – различия достоверны с третьим днем исследований (p≤0,05) **** – различия достоверны с четвертым днем исследований (p≤0,05) .

Также было установлено, что концентрация гемоглобина крови на 1-й, 2-й и 4-й дни исследований (см. табл. 1) в условиях гипоксии, в результате которых в 1-й день она достоверно отличалась от 2-го и 4-го дня. Можно заметить очевидное снижение этого хромопротеида в крови подопытных животных с течением дней эксперимента. Скорее всего, данный эффект вызван кровопотерей, связанной с взятием крови на исследования ежедневно, вместе с этим не исключается влияние кортикостероидов на уровень этого показателя.

Следующей задачей было изучение динамики уровня фибриногена в крови карпов при гипоксии. Фибриноген ‒ важный функциональный показатель системы плазменного гемостаза, обеспечивающий образование сгустка, у исследованных животных в 3-й день эксперимента имел достоверные отличия от 1-го и 4-го дня. Из данных таблицы 2 видно, что к 4-му дню воздействия стресс-факторов количество фибриногена крови значительно выросло.

Таблица 2 ‒ Динамика уровня фибриногена крови рыб в ходе эксперимента

Показатель	1 день, n=8	2 день, n=8	3 день, n=8	4 день, n=8
Фибриноген, г/л	1,3±0,2**	1,3±0,4	1,0±0,2* ***	2,0±0,1**
* – различия достоверны с первым днем исследований (p≤0,05) ** – различия достоверны с третьим днем исследований (p≤0,05) *** – различия достоверны с четвертым днем исследований (p≤0,05).

Корреляционный анализ выявил наличие тесной обратной корреляционной связи между показателями стресс-реакций – гемоглобином и кортизолом, где коэффициент корреляции составил -0,7. Модель регрессии при анализе зависимости этих показателей получилась наиболее качественной (R2 составил 0,44). Графическое изображение корреляционной зависимости стресс-маркеров представлено на рисунке .

Поле корреляции гемоглобина и кортизола

у = -5,3374х+ 473,63

R2 = 0,4439

g о m а. о

♦ Кортизол, нг/мл

---Линейная

(Кортизол, нг/мл)

Рисунок. Графическое изображение корреляционной зависимости и регрессионные модели, описывающие взаимодействия стресс-маркеров

Анализируя эти данные, можно заключить, что оба стресс-маркера достаточно сильно взаимосвязаны, что делает возможным применение любого из них для идентификации стрессовых условий.

Корреляционный анализ также выявил наличие связей средней и высокой степени между уровнем фибриногена и содержанием стресс-маркеров в сыворотке крови у карпов. Так, коэффициент корреляции (R) между фибриногеном и кортизолом составил -0,30, что указывает на обратную зависимость между количеством кортизола и фибриногена. Данный факт может указывать на снижение свертывающей способности крови рыб под влиянием стресса, когда уровень кортизола растет.

В то же время, чем ниже содержание гемоглобина, тем ниже и уровень фибриногена (R= 0,7), что опять же приведет к снижению скорости остановки кровотечения при стрессе.

Выводы

Анализируя динамику уровня кортизола крови после воздействия комплекса стресс-факторов на исследуемых рыб (в 1-й день эксперимента - 287,2±28,9 нг/ мл; во 2-й день ‒ 118,9±56,6 нг/мл; в 3-й день - 333,6±65,2 нг/мл и в 4-й день ‒ 211,8±112,2 нг/мл), можно провести соответствие его колебаний с классической стадийностью стресса. Также было установлено очевидное снижение концентрации гемоглобина в крови в течение эксперимента (в 1-й день ‒ 89,1±2,12 г/л, во 2-й день ‒ 80,3±9,8 г/л, в 4-й день ‒ 52,9±1,9 г/л). По увеличению количества фибриногена крови в течение дней эксперимента (в 1-й день – 1,3 г/л, 2-й день -1,3 г/л ; 3-й день – 1,0 г/л и 4-й день – 2,0 соответственно) можно заключить, что процессы коагуляции ускорились под воздействием гипоксии.

Корреляционно-регрессионный анализ показал, что оба стресс-маркера (кортизол и гемоглобин) достаточно сильно взаимосвязаны, что делает возможным применение любого из них для идентификации стрессовых условий.

Также важно отметить наличие связей средней и высокой степени между показателем вторичного звена гемостаза и содержанием стресс-маркеров в сыворотке крови у карпов, а именно – обнаружена прямая корреляция гемоглобина с уровнем фибриногена и обратная связь кортизола с уровнем фибриногена, при этом коэффициент корреляции 0,7 и -0,3 соответственно. В связи с этим количество фибриногена также можно использовать в качестве биоиндикатора критических для рыб условий.