Дот-блот ИФА тест-система для выявления антител к микобактериям туберкулеза крупного рогатого скота

Одной из важнейших проблем в животноводстве являются инфекционные болезни, среди которых особое место занимает туберкулез крупного рогатого скота. В условиях современного сельскохозяйственного производства, особенно на крупных животноводческих комплексах, где концентрировано большое количество поголовья животных, проведение профилактических мероприятий по обеспечению надежного эпизоотического благополучия и разработка экспресс методов диагностики инфекционных болезней является практической необходимостью.

Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимиче-ского анализа [1]. При этом применяются различные технологии, среди которых немаловажную роль играют модифицированнные методы ИФА, среди которых наиболее перспективными являются методы ИФА в дот-блот варианте.

Целью нашей работы было разработать иммуноферментную тест-систему на основе дот- блот ИФА для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Материалы и методы. Использовали антигенные фракции M.bovis, M.avium и M.nonchromogenes (ДМСО-антигены) полученные на кафедре биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана [3]. Исследуемые сыворотки крови получены из разных районов РТ. В качестве твердой фазы для постановки имму-ноферментной реакции и дот-блот ИФА в непрямом варианте использовали планшеты полистироловые для иммуноферментного анализа производства «Медполимер» (г.Санкт-Петербург) и нитроцеллюлозные мембраны соответственно.

Дот-блот ИФА на нитроцеллюлозных мембранах проводили путем точечного нанесения разведенного антигена на полоски НЦМ и инкубирования их с положительными и отрицательными сыворотками крови .

Для постановки дот-блот иммунофер-ментного анализа полоски нитроцеллюлозной мембраны длиной 6 см и шириной 0,5 см маркировали карандашом на квадратики 5*5 мм для удобства при проведении реакции. Раствор антигена в карбонатном буфере с рН 9,6, наносили на каждый квадратик в объеме 2 мкл.

Для блокировки свободных от антигена мест, НЦМ инкубировали 0,01% раствором альбумина при комнатной температуре в течение 2-х часов. Полоски НЦМ промывали в твинфосфотном буфере, известном, в методике классического ИФА, как промывочный раствор. Рабочий титр и объем исследуемых сывороток крови определяли опытным путем, инкубировали 40 минут при комнатной температуре.

Раствор конъюгата и субстратной смеси наносили в объеме 2 мкл и инкубировали при комнатной температуре 20 и 7 минут соответственно. Реакцию останавливали стопреагентом (2Н раствор серной кислоты).

Результаты исследования и обсуждение. Всего исследовано 197 проб сывороток крови из различных по эпизоотической ситуации хозяйств РТ на выявление антител против возбудителей туберкулеза методом ИФА. Микобактериальные антитела выявляли против антигенов M.bovis, M.avium и M.nonchromogenes.

37 проб (18,8%) при иммунофермент-ном анализе показали положительнные результаты на M.bovis. Из них 21 - одновременно реагировали и с антигеном M.nonchromogenes.

121 проба из общего количества были исследованы в сравнении с результатами ту-беркулинизации, в т.ч. 46 (38,0%) - от реагирующих, 75 (62,0%) –нереагирующих на туберкулин коров. Результаты представлены в таблице 1.

При иммуноферментном анализе проб сывороток крови реагирующих на туберкулин животных, в 21 пробах обнаружены противотуберкулезные антитела в высоких титрах, а в 25 пробах получены отрицательные результаты, что составляет – 45,7% и 54,3% соответственно.

При анализе методом ИФА проб сывороток крови не реагирующих на туберкулин животных (75 проб) были получены следующие результаты: 2 (2,7%) пробы с положительной, 73 (97,3%) пробы с отрицательной реакцией.

Таблица 1 - ИФА проб сывороток крови в сравнении с результатами аллергической пробы коров

Районы	Всего проб	ППД		ИФА		ИФА
		(+)	(-)	(+)	(-)	(+)	(-)
Балтанский	23	13	10	2	11	-	10
Мензелинский	7	7	-	4	3	-	-
Камскаутинс-кий	85	20	65	14	6	2	63
Петречинский	6	6	-	1	5	-	-
ИТОГО: в %	121	46	75	21	25	2	73
		38,0	62	17,4	20,7	1,7	60,3

На следующем этапе исследований оценивали диагностическую эффективность теста на основе дот-блот ИФА при туберкулезе крупного рогатого скота. Исследовали

46 проб сывороток крови из предыдущего опыта. Результаты исследования представле-

ны

в

таблице

Таблица 2 - Результаты дот-блот ИФА сывороток крови в сравнении с результатами ИФА в классическим варианте

Районы	Всего	ИФА		Дот-блот ИФА
		(+)	(-)	(+)	(-)
Балтанский	13	2	11	2	11
Мензелинский	7	4	3	4	3
Камскаутинский	20	14	6	12	8
Петречинский	6	1	5	1	5
ИТОГО	46	21	25	19	27

Результаты исследования проб сывороток крови на туберкулез крупного рогатого скота методом ИФА и дот-блот ИФА в целом совпали, только в 2-х пробах положительных в ИФА не обнаружен противотуберкулезных антител в дот-блот варианте.

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота во многих странах остается напряженной. Туберкулез крупного рогатого скота продолжает распространяться во многих странах, а также стал проявляться в тех регионах, которые долгое время считались благополучными по этому заболеванию [5, 6, 7].

Своевременная диагностика и изолирование больных животных являются главными элементами борьбы с этим заболеванием. Внутрикожная туберкулиновая проба играет ключевую роль в диагностике и контроле туберкулеза крупного рогатого скота. Однако на сегодняшний день этот метод малоэффективен, что обусловлено его недостаточной чувствительностью и специфичностью.

Проведенными ранее исследованиями на разных видах животных показана эффективность серологической диагностики туберкулеза. При этом особое внимание уделяют на выбор микобактериальных антигенов, динамика выработки антител к которым в организме инфицированных животных зависит от стадии развития инфекционного процесса при туберкулезе [2,4].

По результатам нашей работы, установлено, что диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммунофер-ментного анализа с использованием ДМСО-антигенов является достаточно эффективным и дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям. Повышается эффективность диагностических мероприятий, что выражается в увеличении достовер- ности выявления больных туберкулезом животных, а также животных инфицированных другими видами микобактерий.

Технологии ИФА в дот-блот варианте, эффективность которой, при диагностике инфекционных болезней, доказана многими исследователями [1] , вполне можем использоваться и при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

Заключение. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о равноценной диагностической эффективности дот-блот ИФА и классической иммунофермент-ной реакции. Предложенный вариант ИФА может быть использован для экспресс анализа эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах. Несмотря на то, что чувствительность дот-блот ИФА несколько ниже, он обладает рядом преимуществ в сравнении с классическим ИФА к которым относятся простота в постановке, доступность и возможность проведения в полевых условиях.

Резюме

Разработана диагностическая тест-система на основе дот-блот иммуноферментного анализа для проведения скринговых исследований на туберкулез крупного рогатого скота на полевых условиях.

По результатам исследований, установлено, что диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа с использованием ДМСО-антигенов является досто-тачно эффективным и дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям.

Сравнительный анализ диагностической эффективности иммуноферментного анализа (ИФА) в классическом варианте и дот-блот иммуноферментного анализа при туберкулезе крупного рогатого скота, показал возможность использования дот-блот иммуноферментного анализа при выяснении эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в хозяйстве.