Фармакокинетика молекулярной конструкции для депонирования и транспортировки к клеткам- мишеням биологически активных веществ

Создание разнообразных вариантов молекулярных конструкций в виде наночастиц для адресной доставки терапевтических препаратов является интенсивным направлением, нацеленным на конструирование форм препаратов нового поколения. Применение таких молекулярных конструкций в виде наночастиц как средств доставки лекарственных препаратов позволяет использовать значительно меньшие количества активного вещества для получения специфического эффекта и/или получить многократно увеличенный эффект; уменьшить токсический эффект препаратов; изменить фармакокинетику и распределение веществ в клетках организма; защитить биологически активное вещество от биодеградации [1-4].

Особое значение эти исследования имеют для онкологии. Как известно, одной из проблем современной онкологии является низкая селективность накопления противоопухолевых средств тканью опухоли, что обусловливает необходимость введения препаратов в высоких дозах и, как следствие, приводит к развитию широкого спектра токсических эффектов [5]. В связи с этим, разработка средств доставки веществ, обладающих противоопухолевой активностью, чрезвычайно актуальна.

Для оценки пригодности наноконструкций как инструмента доставки фармакологического препарата важную информацию могут дать фармакокинетические исследования, поскольку они позволяют выявить тропность к органам и тканям, динамику накопления и скорость элиминации наночастицы из организма.

Ранее во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» была получена молекулярная конструкция, в центре которой находится нуклеотидный материал (двуспиральные РНК), покрытый оболочкой из спермидина и поли-глюкина. Данные частицы в физиологических усло-92

виях имеют сферическую вирусоподобную форму, в связи с чем, получили название «вирусоподобная частица» (ВПЧ).

На основе этой конструкции и антигенов инфекционных агентов были получены экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ, туберкулеза, клещевого энцефалита, показана их высокая эффективность при иммунизации лабораторных животных [6, 7]. Успешные результаты, полученные в процессе разработки вакцин, явились основанием для исследования данной молекулярной конструкции как средства доставки терапевтических препаратов.

Как указывалось выше, особенностью этой конструкции является наличие в ее центральной части дсРНК, которая является индуктором интерферона, стимулятором неспецифической резистентности, обладает свойствами усиливать противоопухолевые, иммунотропные свойства фармакологических препаратов. Поэтому выяснение распределения и выведения дсРНК в составе наноконструкции имеет важное значение для создания средств противоопухолевого и иммуностимулирующего действия.

Целью данной работы являлась оценка фармакокинетических свойств препарата ВПЧ на мышах-опухоленосителях для заключения о пригодности наноконструкции данного типа как средства адресной доставки препаратов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследованиях использовали препарат ВПЧ, содержащий в центральной части радиоактивно меченый препарат дсРНК. Введение радиоактивной метки [гамма-32Р] по 5'-концу дсРНК проводили с использованием полинуклеотидкиназы и [гам-ма-32Р] ATФ согласно процедуре, описанной Остерманом Л.А. [8]. Меченую дсРНК очищали двукратным переосаждением этиловым спиртом [8]. Удельная радиоактивность дсРНК, меченой фосфором, составляла 7,3*108 имп/мин/мг. Препарат вирусоподобной частицы был получен методом, описанным ранее Сизовым А.А. с соавт. [9]. В качестве препарата сравнения использовали радиоактивно меченый препарат дсРНК.

Исследования проводили на мышах-опухоле-носителях с солидной формой перевивной карциномы Эрлиха. Опухолевые клетки, полученные от мышей-доноров на 6-е сутки после трансплантации, перевивали мышам внутримышечно в дозе 105 клеток на животное в объеме 0,1 мл в правую заднюю лапу. На 6-е сутки после перевивки опухоли животные были разделены на 3 экспериментальные группы, по 24 особи в каждой. Мышам первой, опытной, группы вводили смесь немеченого и меченого препарата ВПЧ в дозе 0,01 мг дсРНК/мышь и 0,7 млн. имп/ мин/ мышь соответственно. Использованная доза препарата составляла 0,5 мг дсРНК/кг массы тела и относилась к диапазону эффективных доз дсРНК. Препарат вводили однократно внутри- венно в хвостовую вену мышей в объёме 0,1 мл на животное.

Мыши второй группы получали инъекции смеси меченой и немеченой дсРНК в той же дозе и объеме, как препарат ВПЧ.

Данные экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ «Statgraphics, Vers. 5.0» (Statistical Graphics Corp., USA). Статистическую значимость обнаруженных различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика выведения меченых препаратов ВПЧ и дсРНК из сыворотки крови мышей представлена на рис. 1. Видно, что максимальное содержание радиоактивной метки в сыворотке крови наблюдалось через 5 мин (0,08 ч) после введения. Кривая элиминации препарата ВПЧ во все сроки наблюдения не отличалась от кривой выведения дсРНК. Через 48 ч после введения препаратов в сыворотке крови оставалось 0,12% от введенного радиоактивного препарата.

Анализ показал, что значения удельной радиоактивности всех внутренних органов уже через 4 ч после введения меченого препарата ВПЧ превышали ее содержание в крови (таблица). Это свидетельствует о том, что препарат ВПЧ так же, как препарат сравнения дсРНК, быстро выводится из крови и накапливается в ткани органов.

Анализ динамики накопления радиоактивности в органах мышей контрольной группы показал, что

Рис. 1. Динамика изменения содержания меченой дсРНК в сыворотке крови мышей после однократного внутривенного введения беспородным мышам препаратов ВПЧ и дсРНК (в процентах от введенного)

в ранние сроки после введения препарата дсРНК (0,08 ч) значения удельной радиоактивности были наиболее высокими в почках, сыворотке крови и коже мышей (таблица). Значения показателя остальных исследуемых органов в этот срок колебались в диапазоне (9,88-18,3)*103 имп/мин/г.

Через 0,5 часа после введения дсРНК уровень радиоактивности в почках контрольных мышей снижался в 1,3 раза, через 48 часов – в 4,4 раза. В коже контрольных животных было отмечено постепенное снижение показателя к концу периода наблюдения (в 2 раза ниже, чем в начальной точке). Значение показателя в печени мышей повышалось через 0,5 ч после введения дсРНК, затем оставалось неизмен-

Таблица

Удельная радиоактивность органов и сыворотки крови мышей после введения препаратов, меченых [гамма-32Р], *103 имп/мин/г массы ткани

Орган/ биологическая жидкость	Препарат	Время после введения, ч
		0,08	0,5	1	4	24	48
Сыворотка крови	ВПЧ дсРНК	56,8±2,9 47,5±6,7	13,4±1,2 14,3±0,6	8,59±0,50 7,71±1,76	4,95±0,22 4,98±0,30	2,78±0,22 3,11±0,23	1,63±0,21 2,10±0,21
Печень	ВПЧ дсРНК	15,0±1,4 9,88±3,01	22,4±3,5 20,1±0,2	22,0±0,9 19,1±0,7	18,6±0,8 19,6±0,7	6,73±0,17 7,83±0,32	4,94±0,37 6,35±0,48
Почки	ВПЧ дсРНК	89,5±8,0 60,8±14,3	44,3±6,3 45,8±2,1	31,4±1,9 33,0±1,9	28,5±1,6 30,6±2,1	14,1±0,4 15,4±1,0	10,2±0,8 * 13,7±1,3
Кишечник	ВПЧ дсРНК	17,1±,1 15,5±3,8	32,8±3,2 33,2±2,7	37,6±3,8 34,7±4,9	32,8±4,0 35,6±4,3	27,8±2,2 31,8±0,7	19,7±1,4 * 27,5±3,1
Опухоль	ВПЧ дсРНК	16,0±1,1 * 10,3±2,2	11,4±1,3 12,5±2,4	10,2±0,3 10,3±0,2	15,3±1,0 14,4±0,7	11,5±0,8 13,1±1,7	11,3±1,7 9,27±0,2
Мышца	ВПЧ дсРНК	15,3±1,4 12,2±2,6	19,5±1,8 22,0±3,5	20,8±2,0 21,4±1,2	29,1±2,6 30,2±2,8	16,9±0,9 * 22,0±0,9	13,9±1,4 * 18,7±1,2
Кожа	ВПЧ дсРНК	35,9±4,8 23,6±4,3	16,7±1,2 19,3±1,5	14,1±0,2 15,2±0,4	17,8±1,5 16,1±2,0	13,3±1,7 15,8±1,5	11,5±0,8 11,5±1,3
Селезенка	ВПЧ дсРНК	17,6±1,3 18,3±5,6	35,0±1,6 * 48,8±5,7	38,4±2,4 33,9±1,8	32,8±2,6 38,5±2,4	26,1±1,0 * 31,1±0,3	13,7±1,2 * 19,2±1,8

Различия статистически значимы: * - по отношению к показателям мышей после введения дсРНК, р < 0,05.

ным в течение четырех часов наблюдения и снижалось лишь к концу первых суток. Уровень радиоактивности опухоли контрольных животных повышался через 4 ч после введения препарата и оставался неизменным до конца первых суток, после чего снижался до значения, которое было зарегистрировано в начальный период после введения.

В ткани селезенки и кишечника было отмечено нарастание содержания меченого препарата через 0,5 ч после введения, сохранявшееся в течение суток. Через 48 ч после введения дсРНК значение ра-диоактивости ткани селезенки снижалось до уровня, зарегистрированного в начальный период наблюдения, а значение показателя в ткани кишечника оставалось повышенным и через двое суток. Повышение показателей радиоактивности в скелетной мышце наблюдали за период от 0,5 до 4 ч после введения препарата, с последующим снижением, которое все еще было выше исходного показателя на 53%.

Через 5 мин после введения меченого препарата ВПЧ наибольшую удельную радиоактивность наблюдали в ткани почек, сыворотке крови и коже (таблица). Содержание меченого препарата в тканях печени, кишечника, мышцы, кожи и селезенки в этот срок колебалось в пределах (15-17,6)*103 имп/мин/г. Значения радиоактивности почек, печени и кожи мышей, которым вводили ВПЧ, в этот период были в 1,5 раза выше соответствующих показателей животных, получавших инъекции дсРНК.

В последующие сроки наблюдения в группе мышей, которым вводили препарат ВПЧ, наблюдали изменения радиоактивности органов, аналогичные изменениям, зарегистрированным для контрольного препарата. Через 0,5 ч после введения уровни радиоактивности почек, сыворотки и кожи снижались в 2, 4,2 и 2,2 раза соответственно по отношению к уровню, зарегистрированному через 5 мин. после введения, и продолжали уменьшаться до конца эксперимента. Однако различий между данными, полученными у двух групп животных, не обнаружено.

Через 0,5 ч после введения ВПЧ удельное содержание меченой дсРНК в тканях кишечника и селезенки возрастало в 2 раза, сохранялось в течение 4 ч и в дальнейшем снижалось. Следует отметить, что через 24 и 48 ч удельная активность меченого препарата в селезенке опытной группы была ниже, чем в контроле (Р<0,05).

Умеренно повышенное содержание меченого препарата в печени отмечалось в течение четырех часов и снижалось только через сутки после введения ВПЧ.

Незначительное увеличение уровня радиоактивности ткани мышцы наблюдали через 4 ч после введения препарата ВПЧ с последующим статистически значимым снижением показателя через 24 и 48 ч, по сравнению с показателем контрольной группы.

В ткани опухоли во все сроки наблюдали умеренное по величине накопление меченого препарата. Следует отметить, что через 5 мин после введения 94

0.08 0.5 1 4 24 48

Время после введения препарата,ч

Рис. 2. Уровень удельной радиоактивности в опухоли после введения препаратов ВПЧ и дсРНК, меченых [гамма-32Р].

* – различия статистически значимы по отношению к дсРНК, р≤0,05

препарата ВПЧ уровень радиоактивности в ткани опухоли опытных животных был статистически значимо выше показателя животных, которым вводили дсРНК (рис. 2).

Расчет уровня остаточной радиоактивности в сыворотке крови и органах мышей показал, что значения показателя через 48 ч после введения в большинстве органов составляли 0,1-0,4% от введенной дозы, за исключением печени, где значения показателя были несколько выше (0,60–0,80% от величины введенной дозы). На основании этих данных можно заключить, что препарат ВПЧ, в основном, выводился из организма мышей так же, как препарат сравнения дсРНК, в течение двух суток после введения.

Таким образом, показано, что препарат ВПЧ при внутривенном введении быстро элиминировался из кровеносного русла и распределялся по периферическим органам и тканям. Наиболее высоким содержание препарата было в почках, селезенке, кишечнике. Основным путем выведения препарата ВПЧ, так же, как препарата сравнения дсРНК, являлись почки, о чем свидетельствует высокий уровень радиоактивности данного органа. Препарат ВПЧ более интенсивно накапливался в ткани опухоли по сравнению с препаратом дсРНК. Процесс элиминации препарата ВПЧ из организма лабораторных животных, в основном, завершался к концу вторых суток после введения.

Полученные результаты свидетельствуют о пригодности данной наноконструкции, включающей дсРНК, как средства доставки препаратов противоопухолевого действия.

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке Федеральной Целевой Научно-технической Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы», госконтракт №02.513.11.3372 «Конструирование нанобиочастиц – носителей терапевтических средств для доставки к клеткам-мишеням – и оценка их безопасности».