Фармакокинетика пептидного ингибитора RAS-ГТфазы ИНГ-РАС

Многоклеточные организмы имеют сложную структуру, и для того, чтобы существовать и функционировать должным образом, каждая клетка должна быть способна передавать сигнал другим клеткам. Для общения эти клетки часто посылают молекулярные химические сигналы, которые действуют на рецепторы других клеток. Существуют различные варианты передачи этих сигналов. Клетки могут сами вырабатывать сигналы, направленные на их собственные рецепторы. Такой механизм называется аутокринными сигналами [1]. Если сигналы вырабатываются клеткой и направляются к клеткам-мишеням, находящимся рядом, путем пассивной диффузии через межклеточную жидкость, это называется паракринной сигнализацией [2]. А эндокринные сигналы, это сигналы, которые вырабатываются клеткой и направляются к клеткам-мишеням, находящимся далеко. Примерами такой сигнализации являются гормоны, которые выделяются в кровь, и цитокины, которые могут высвобождаться в месте повреждения и воздействовать, например, на мозг, вызывая лихорадку [3].

Сигнальные молекулы или лиганды могут быть гидрофобными (имеют тенденцию отталкивать воду) или гидрофильными (имеют тенденцию оставаться в воде) (рис. 1). Гидрофобные сигнальные молекулы не могут свободно плавать во внеклеточном пространстве, поэтому они доставляются в клетки-мишени белками-носителями. Гидрофобные молекулы могут диффундировать через клеточную мембрану и связываться с белками-рецепторами внутри клетки-мишени либо в цитоплазме, либо в ядре. Большинство сигнальных молекул являются гидрофильными, поэтому они могут свободно плавать во внеклеточном пространстве, чтобы достичь клеток-мишеней, но затем не могут пересечь клеточную мембрану [4]. Чтобы передать сигнал гидрофильные молекулы связываются с рецепторами на поверхности клетки. Эти рецепторы представляют собой трансмембранные белки с внеклеточным концом, который связывается с лигандом (сигнальной молекулой), и внутриклеточным концом, который запускает сигнальный путь внутри клетки. После этого происходит трансдукция. Это означает, что рецепторный белок изменяется и это активирует внутриклеточные молекулы - вторичные мессенджеры, и в конце происходит ответ клеток на сигнал [5].

МЕМБРАННЫЙ РЕЦЕПТОР

Плазматическая мембрана

Рецептор

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР

Гидрофобная сигнальная молекула

Гидрофильная сигнальная молекула

Белок-переносчик

Ядро

Внутриклеточный рецептор

Рис. 1. Мембранный и внутриклеточный рецепторы [6].

Существуют три основных класса рецепторов: рецепторы, связанные с G-белками, рецепторы, связанные с ферментами, и рецепторы ионных каналов [7] (рис. 2).

Рис. 2. Разные классы рецепторов.

Из этих трех классов рецепторов, каналообразующие рецепторы вызывает открытие ионного канала на клеточной мембране после связывания лиганда с ними. Рецепторы, связанные с G-белками, в основном, тоже активируются после связывания лиганда и влияют на ферменты, которые образуют вторичные мессенджеры и передают сигнал на внутриклеточные белки. И, наконец, рецепторы с ферментативной активностью активируют свой внутренний домен при взаимодействии с лигандом, который имеет каталитическую активность. Именно этот рецептор связан с RAS (Retrovirus Associated DNA Sequences/Rat sarcoma).

Семейство генов RAS включает 3 гена: KRAS , HRAS , NRAS . Первые два гена получили название от своих гомологов, выделенных из линий вирусов мышиной саркомы Kirsten и Harvey, последний был идентифицирован в клеточной линии нейробластомы. Три гена кодируют четыре варианта протеинов – два типа KRAS, А и В, и по одному типу HRAS и NRAS. Все они относятся к белкам, связывающим энергетическую молекулу ГТФ. RAS-белки могут существовать в двух формах: неактивной, GDP, и активной, GTP-связанной. Благодаря собственной GTP-азной активности, а также под действием факторов обмена (Sos и др.), белок RAS циклически переходит из GTP-связанной активной формы в GDP-связанную неактивную и обратно.

В норме RAS находится преимущественно в неактивной, GDP-связанной форме. Активация RAS регулируется рецепторной тирозинкиназой EGFR. После связывания рецепторной внеклеточной части тирозинкиназы с фактором роста и ее димеризации происходит взаимное фосфорилирование ее внутриклеточных доменов. Фосфорилирование создает активную конформацию киназы. Образование активного комплекса RAS-GTP происходит в присутствии активирующего GTP-азу белка GAP, в сотни раз ускоряющего гидролиз. После гидролитического превращения GTP в GDP RAS снова инактивируется. Сигнал прерывается. Чтобы воспринять новый сигнал, если он еще существует вне клетки, цикл реактивации должен быть повторен. Таким образом, каскадная последовательность реакций сигнального пути RAS действует как включатель, определяющий регуляцию генной экспрессии, необходимую для реализации деления или дифференцировки клетки (рис. 3).

Выживаемость

МЕК2

Сигнальный каскад RAS

Выживаемость Пролиферация Ангиогенез Миграция

Рис. 3. Сигнальный каскад RAS [8].

Сигнальный каскад RAS/MAPK

-- RAS опосредованный каскад

Membrana

Белок, ускоряющий гидролиз и факторобмена

Сигнальный каскад PI3K/AKT

МЕК1

ERK1/3

RAS-белки часто упоминают как протоонкогенные продукты: их постоянная активация ведет к злокачественному перерождению клеток. Характерный механизм перерождения RAS – точечные мутации в соответствующих генах. Мутации в гене KRAS в опухолях толстой кишки встречаются в 30-60% случаев. Наиболее часто мутации KRAS определяются в экзоне 2, кодонах 12 и 13. Однако описаны мутации в экзоне 3, кодоне 61, и в экзоне 4, кодонах 117 и 146. Мутации в гене NRAS при коло-ректальном раке составляют до 5%. Мутации в гене HRAS при аденокарциноме толстой кишки не описаны (табл. 1).

Табл. 1. Мутации генов семейства RAS при злокачественных опухолях [9]

Орган	Тип опухоли	Мутации (%)
		HRAS	KRAS	NRAS
Колоректальный рак	Аденокарцинома	0	42	5
Желчные пути	Аденокарцинома	0	35	2
Мочевой пузырь	Уротелиальная карцинома	12	4	2
Печень	Гепатоцеллюлярный рак	0	4	4
Легкое	Крупноклеточный рак	4	21	4
	Аденокарцинома	0	16	1

Поджелудочная	Протоковая	0	69	1
железа	аденокарцинома
	Эндокринная опухоль	0	1	75
Кожа	Меланома	1	2	20

Ras - один из самых распространенных человеческих онкогенов, но до сих пор ни один зарегистрированный противораковый препарат не действует на эту мишень. Исследования показывают, что 25% всех опухолей имеют нарушение MAPK/ERK сигнального пути вследствие мутаций генов семейства RAS. Этот показатель возрастает до 50% при колоректальном раке и до 90% при опухолях таких локализаций, как рак поджелудочной железы и нейробластома. Поскольку мутации RAS являются частой причиной опухолевого генеза, продукт этих мутаций представляет собой перспективную молекулярную мишень для разработки и поиска новых противоопухолевых препаратов. Таким образом, проведение доклинических исследований препарата на основе пептидного ингибитора Ras-ГТФазы является актуальной и, несомненно, практически важной задачей [10].

Разрабатываемое противоопухолевое лекарственное средство представляет собой химерный пептид, на N-конце которого находится интернализуемая последовательность, способная проникать сквозь плазматическую мембрану эукариотических клеток и переносить через мембрану другие полипептиды. С-конец пептида представляет собой фрагмент Raf-киназы, который связывается с Ras-ГТФазами. Связывание пептида препятствует образованию тройного комплекса Ras-Raf-GTP, что приводит к ингибированию сигнального пути MAPK/ERK. При этом N-концевая последовательность химерного пептида необходима для проникновения С-концевой последовательности в клетку. Мутации генов Ras-ГТФаз, которые приводят к гиперактивации сигнального пути MAPK/ERK, наблюдаются при многих онкологических болезнях. Мутации приводят к тому, что Ras-киназа постоянно находится в комплексе с GTP. Двойной комплекс Ras-GTPc с высокой аффинностью связывает Raf-киназу, в результате чего образуется активный тройной комплекс Ras-Raf-GTP, который фосфорилирует киназу MEK и таким образом передает сигнал дальше по киназному каскаду. Разрабатываемый препарат связывается с активным комплексом Ras-GFP через сайт связывания Raf-киназы и предотвращает образование активного тройного комплекса Ras-Raf-GTP, тем самым ингибируя сигнальный путь MAPK/ERK.

Материалы и методы

Фармакокинетика пептидного ингибитора Ras-ГТФазы была изучена на 36 самцах крыс Sprague-Dawley (SD) и 12 самцах кроликов калифорнийской породы (табл. 2). Тестируемый препарат вводили животным в двух экспериментальных дозах 15 мг/кг и 50 мг/кг однократно внутривенно: крысам - в хвостовую вену в объеме 2 мл/кг, кроликам – в ушную вену в объеме 1,5 мл/кг. Через 1, 3, 5, 10, 20, 30, 60, 120, 240, 480 минут после введения препарата отбирали образцы крови в пробирки с антикоагулянтом, центрифугировали для получения плазмы, которую хранили при -20 оС до момента передачи на анализ в аналитическую лабораторию. Количественный анализ ингибитора Ras-ГТФазы в плазме крови был выполнен с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) системы

Shimadzu LC-30. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Табл. 2. Исследованные группы животных и дозы препарата: ингибитора Ras-ГТФазы в 0,9% растворе NaCl

Животные	№ группы	Доза препарата мг/кг	Количество животных (самцы)	Время забора крови (минут после введения)
Крысы	1		6	1, 10, 60, 480
	2	50	6	3, 20, 120
	3		6	5, 30, 240
	4		6	1, 10, 60, 480
	5	15	6	3, 20, 120
	6		6	5, 30, 240
Кролики	1 2	50 15	6 6	1, 3, 5, 10, 20, 30, 60, 120, 240, 480

Данное исследование выполнялось в соответствии с требованиями действующего Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств (под ред. А.Н. Миронова, М.: Гриф и К, 2012) и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №708н от 23.08.2010 и Национальный стандарт Российской федерации, ГОСТ Р 53434 – 2009).

Результаты и обсуждение

Полученные результаты позволяют сделать ряд выводов о фармакокинетике ингибитора RAS-ГТФазы при внутривенном способе введения у крыс и кроликов. Концентрация ингибитора RAS-ГТФазы в плазме крови крыс, определяемая через 1 минуту, составляет порядка 180 мкг/мл (184±12) при дозе 15 мг/кг (рис. 4) и 460 мкг/мл (462±28) при дозе 50 мг/кг (рис. 5). Снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания порядка 4-5 минут (4,58 минуты при дозе 15 мг/кг; 4,18 минуты при дозе 50 мг/кг). Общее среднее время присутствия препарата в организме составляет порядка 5 мин. Величина кажущегося стационарного объема распределения составляет порядка 90100 мл/кг (89,7 мл/кг при дозе 15 мг/кг; 102,8 мл/кг при дозе 50 мг/кг).

Концентрация ингибитора RAS-ГТФ-азы в плазме крови кроликов, определяемая через 1 минуту составляет порядка 160 мкг/мл (159±10) при дозе 15 мг/кг (рис. 6) и 590 мкг/мл (589±15) при дозе 50 мг/кг (рис. 7). Снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания порядка 4-5 минут (5,25 минут при дозе 15 мг/кг, 4,63 минуты при дозе 50 мг/кг). Общее среднее время присутствия препарата в организме составляет порядка 6 мин. Величина кажущегося стационарного объема распределения составляет порядка 80-85 мл/кг (83,0 мл/кг при дозе 15 мг/кг; 84,5 мл/кг при дозе 50 мг/кг) (табл. 3).

Рис. 4. Концентрация субстанции ингибитора RAS-ГТФ-азы в плазме крови крыс (по оси ординат) с дозой 15 мг/кг. Цветом обозначены номера групп.

Рис. 5. Концентрация субстанции ингибитора RAS-ГТФ-азы (по оси ординат) в плазме крови крыс с дозой 50 мг/кг. Цветом обозначены номера групп.

30 мин   60 мин 120 мин 240 мин 480 мин

с    ~ группа 1   ^^^^^ группа 2   ^^^^^ группа 3   ^^^^^ группа 4  ^^^^^^ группа 5   ^^^^^ группа 6

Рис. 6. Концентрация субстанции ингибитора RAS-ГТФ-азы (по оси ординат) в плазме крови кроликов с дозой 15 мг/кг.

Г     : группа 1   ^^^^^™ группа 2   ^^^^^™ группа 3

группа 4  ^^^^^™ группа 5   ^^^^^™ группа 6

Рис. 7. Концентрация субстанции ингибитора RAS-ГТФ-азы (по оси ординат) в плазме крови кроликов с дозой 50 мг/кг.

Табл. 3. Фармакокинетические показатели субстанции ингибитора RAS-ГТФ-азы в плазме крови крыс и кроликов

Группа/доза	Cmax (мкг/мл)	AUC (0→1) (час*мкг/мл)	AUC (0→8) (час*мкг/мл)	Cl (л/ч*кг)	AUMC (час^2* нг/мл)
Крысы, 15 мг/кг	160,71	13,31	13,32	1,13	1,06
Крысы, 50 мг/кг	468,02	37,81	37,82	1,32	2,94
Кролики, 15 мг/кг	180,63	17,31	17,35	0,86	1,69
Кролики, 50 мг/кг	591,78	56,04	56,08	0,89	5,39
Группа/доза	MRT (мин)	V 0 (мл/кг)	Vss (мл/кг)	T 1/2 (мин)
Крысы,   15 мг/кг	4,78	93,3	89,7	4,58
Крысы,   50 мг/кг	4,67	106,8	102,8	4,18
Кролики,  15 мг/кг	5,87	83,0	84,5	5,25
Кролики, 50 мг/кг	5,77	84,5	85,7	4,63

Примечание. Cmax:   максимальная концентрация;   AUC(0→1):   площадь под фармакокинетической кривой «концентрация лекарственного вещества – время», к 1 часу; AUC(0→8): площадь под фармакокинетической кривой «концентрация лекарственного вещества – время», к 8 часам; Cl: клиренс; AUMC(0→t): площадь под фармакокинетической кривой «концентрация лекарственного веществахвремя - время», MRT: среднее время пребывания в организме; V0: центральный объем распределения; Vss: стационарный объем распределения; T1/2: время полувыведения.

Заключение

На основании результатов исследования были получены следующие характеристики исследуемого препарата:

• •    Концентрация ингибитора RAS-ГТФазы в плазме крови, определяемая через 1 минуту, составляет у крыс порядка 180 мкг/мл (184±12) при введении дозы 15 мг/кг и 460 мкг/мл (462±28) при введении дозы 50 мг/кг; у кроликов - порядка 160 мкг/мл (159±10) при введении дозы 15 мг/кг и 590 мкг/мл (589±15) при введении дозы 50 мг/кг.

• •    Снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания порядка 4-5 минут (4,58 минуты при введении дозы 15 мг/кг и 4,18 минуты при введении дозы 50

мг/кг) у крыс и (5,25 минут при введении дозы 15 мг/кг и 4,63 минуты при введении дозы 50 мг/кг) у кроликов.

• •    Величина кажущегося стационарного объема распределения (Vss) составляет порядка 90-100 мл/кг (89,7 мл/кг при введении дозы 15 мг/кг и 102,8 мл/кг при введении дозы 50 мг/кг) у крыс и порядка 80-85 мл/кг (83,0 мл/кг при введении дозы 15 мг/кг и 84,5 мл/кг при введении дозы 50 мг/кг).

Вклад авторов. В.К. Боженко: научное руководство, концепция исследования, развитие методологии; Т.М. Кулинич: концепция исследования, развитие методологии, проведение экспериментальных исследований; Р. Ранджит: статистическая обработка, подготовка иллюстративного материала; А.В. Иванов: сбор и обработка информации, проведение экспериментальных исследований; А.М. Шишкин: проведение экспериментальных исследований, написание исходного текста, итоговые выводы; Я.Ю. Киселева: проведение экспериментальных исследований, написание исходного текста, итоговые выводы; О.Б. Князева:  статистическая обработка, подготовка иллюстративного материала; В.А.

Солодкий: научное руководство, концепция исследования, развитие методологии. Все авторы прочитали и согласились с версией рукописи, представленной для публикации.

Финансирование – собственные средства ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России.

Декларация по этике для исследований с использованием животных

Протокол исследования на животных был одобрен независимым этическим комитетом ФГБУ РНЦРР Минздрава России, протокол № 5 от 27.05.2022 г.