Фено-генотипический профиль антибиотикорезистентности культур микроорганизмов, выделенных от сельскохозяйственных животных и технологического оборудования животноводческих помещений

Современные        интенсивные технологии ведения животноводческой отрасли позволяют существенно повысить продуктивность,    эффективность    и значительно снизить финансовые затраты на производство единицы продукции, но зачастую это происходит на фоне снижения естественной резистентности животных к инфекциям, загрязнения окружающей среды и негативного влияния на здоровье человека [2,  3,  4,  8]. В большинстве случаев, для профилактики и лечения тех или иных инфекционных болезней бактериальной этиологии используют антибиотические препараты [1, 5, 6, 7].

По экспертным прогнозам, ряда исследователей к 2030 году количество антибиотиков,      применяемых      в животноводческой    отрасли,    может увеличиться в среднем на 10,5-11,5 %, это составит около 200235 тонн [11]. Кроме того, установлено, что до 75,0  % антибиотических     препаратов     не усваивается                 организмом сельскохозяйственных животных и птиц, и они выводятся через фекалии и мочу, что приводит к загрязнению окружающей среды. В научной литературе появляется всё больше фактов доказывающих, что антибиотикорезистентность бактериальных агентов у людей в подавляющем большинстве случаев связана с широким применением как терапевтических, так и нетерапевтических антибиотиков у сельскохозяйственных животных [1, 2, 3, 4, 5, 8, 9].

В ряде работ показано, что животноводческие и птицеводческие хозяйства могут служить значительным резервуаром резистентных к антибиотикам бактерий и генов устойчивости, что в свою очередь является новой и трудно прогнозируемой проблемой, связанной с угрозами для здоровья человека и животных в глобальном масштабе [13, 14].

Необходимо отметить, что определенная доля резистентности к антимикробным препаратам появилась вследствие применения указанных препаратов для сельскохозяйственных животных и птиц с последующей передачей устойчивых микроорганизмов и генов резистентности между животными и их продуктами. Некоторые авторы указывают на прямую связь между использованием антибиотических препаратов и резистентностью к противомикробным веществам у культур Escherichia coli выделенных от свиней, крупного рогатого скота и птиц [14].

Кроме того, важным резервуаром и каналом распространения генов резистентности у бактерий к антибиотикам служит окружающая среда. Показано, что основными источниками попадания в окружающую среду антибиотиков, генов резистентности к противомикробным препаратам от сельскохозяйственных животных является навоз, почва, вода, животноводческие продукты. В этом плане все сельскохозяйственные животные служат важными экологическими резервуарами устойчивых к антибиотикам бактерий и генов резистентности [9, 10, 14].

Учитывая вышеизложенное, целью настоящего исследования явилось: определение фенотипических характеристик и генотипических детерминант антибиотикорезистентности у культур микроорганизмов, выделенных от сельскохозяйственных животных и технологического оборудования.

Материал и методы исследований. Материалом для исследования служил биологический материл (пробы фекалий, молока, вагинальные и с технологического оборудования) различных видов сельскохозяйственных животных, содержащихся в хозяйствах Омской области.

Микробиологические исследования проводили согласно методическим рекомендациям.

Часть проб биологического материала подвергли MALDI-TOF масс-спектрометрии (время пролётная матрично-ассоциированная лазерная десорбционная ионизационная масс-спектрометрия) с помощью прибора VITEKMS (Bio Merieux, производство Франция); масс-спектры РНК белков и бактерий сопоставляли с базой данных.

Фенотипическую чувствительность выделенных культур микроорганизмов к антибиотикам определяли с помощью стандартного диско-диффузионного метода. Интерпретацию результатов теста проводили в соответствии с национальным стандартом, рекомендуемыми экспертными правилами EUCAST (20182022 гг.).

Определение генетических детерминант антибиотикорезистентности проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов компании ООО НПФ «Литекс» (РФ), с помощью анализатора CFX-96 (Bio-Rad, USA).

Биостатическую обработку данных осуществляли

с

стандартного пакета Excel.

использованием анализа Microsoft

Результат исследований. Анализ фенотипических

детерминант

антибиотикорезистентности выделенных культур

микроорганизмов

показал

относительно широкую вариабельность их значений в отношении тестируемых фармакологических групп антимикробных препаратов, и аминогликозидам полусинтетическим

в частности, к

III      поколения, пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз, фторхинолам, цефалоспоринам I, II и III поколения, пенициллинам,

макролидам

и

тетрациклинам. Установлено, что наиболее часто культуры, выделенные из проб молока коров, резистентность проявляют 100

к

амикацину

% и

цефалексину. В частности, все выделенные культуры E. coli резистентность ципрофлоксацину, моксифлоксацину, показали 100  %

к

амикацину, цефтриаксону, тетрациклину,

доксициклину и цефалексину. Несколько меньшую резистентность культуры проявили в отношении ломифлоксацина, цефепима, левофлоксацина (16,6 %). В то же

время,

наиболее

чувствительность культуры высокую

E. coli

проявили в отношении антибактериальных препаратов, относящихся к 3 группам, в частности, фторхинолам, цефалоспоринам III поколения и макролидам.

Схожие

фенотипические

особенности резистентности наблюдаются и относительно культур Staph. aureus, выделенных из проб молока коров. Так, все выделенные культуры Staph. aureus показали

устойчивость

антибактериальным фармакологических аминогликозидам полусинтетическим ингибиторам фторхинолонам, препаратам

к

групп, III

а именно:

поколения,

пенициллинам + бета-лактамаз, цефалоспоринам   III

поколения и макролидам. Все выделенные культуры Staph. haemolyticus были резистентны к амоксиклаву (полусентетическим пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз), цефтриаксону (цефалоспорины III поколения), тетрациклину (тетрациклины), цефалексину (цефалоспорины).

Частотный анализ резистентности культур Staph. epidermidis показал, что 100 % выделенных культур микроорганизмов были резистентны к антибиотикам 5 групп, в частности, к аминогликозидам III поколения, полусинтетическим пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз, цефалоспоринам I и III поколения, пенициллинам, тетрациклинам.

Анализ фенотипической антибиотикорезистентности E. coli , обнаруженных в вагинальных смывах, показал, что все изоляты были резистентны к цефтриаксону, моксифлоксацину, доксициклину, энтрофлоксацину, эритромицину и цефалексину. Необходимо отметить, что не обнаружены культуры, которые в 100 % случаев были чувствительны к тестируемым противомикробным препаратам. Так, максимальная доля чувствительных культур E. сoli находилась на уровне 96 % (цефтазидим), и минимальная составила 20 % (левофлоксацин и ампициллин).

Среди доминирующих культур микроорганизмов, выделенных из вагинальных смывов коров, наименьшее количество культур резистентных к тестируемым антибактериальным препаратам выявлено в отношении Bacillus subtilis (от 25,0 % до 37,5 %). Установлено, что культуры P. mirabilis были резистентны к аминогликозидам (амикацин), полусинтетическим пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз (амоксиклав), фторхинолам (ципрофлоксацин, ломефлоксацин), цефалоспоринам (цефтриаксон), пенициллинам (ампициллин), тетрациклинам (доксициклин).

Большинство культур E. coli, выделенных из проб фекалий сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот), были резистентны к амикацину, амоксиклаву, ломефлоксацину, цефепиму, ампициллину, доксициклину, эритромицину и цефалексину в 100 % случаев, ципрофлоксацину (83,3 %), цефотаксиму (72,2 %), цефтриаксону (88,8 %), тетрациклину (94,4 %), но проявили 100 % чувствительность к цефтазимиду, левофлоксацину, энтерофлоксацину, азитромицину.

Тестируемые культуры Staph. aureus, выделенные из проб фекалий сельскохозяйственных животных, показали относительно широкий диапазон резистентности к антимикробным препаратам. Так, все культуры были резистентны к ампициллину, моксифлоксацину, тетрациклину, эритромицину. От 90,0 до 55,0 % изолятов Staph. aureus характеризовались фенотипической устойчивостью к антимикробным препаратам 6 фармакологических групп, в частности: аминогликозидам, полусинтетическим пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз, фторхинолонам, цефалоспоринам III и IV поколения, микролидам-азалидам, тетрациклинам. В то же время от 70,0 до 35,0 % культур Staph. aureus были чувствительны к цефтазидиму, азитромицину, доксициклину и цефалексину. Все выделенные из проб фекалий культуры P. vulgaris были резистентны к амикацину, ципрофлоксацину, цефотаксиму, цефепиму, ампициллину, азитромицину, энрофлоксацину. Часть культур, а именно 83,0 % были резистентны к амоксиклаву, ломерофлоксацину (66,6 %), цефтазидиму (83,3 %), доксициклину (83,3 %) и тетрациклину (83,3 %). В то же время все культуры Proteus vulgaris были чувствительны к эритромицину, цефалексину и цефтриаксону.

Установлено, что все культуры бактерий Staph. aureus, E. coli, P. aeruginosa и E. cloacae, выделенные из смывов с технологического оборудования животноводческих помещений были резистентны к амикацину и цефотаксиму. Кроме того, все изоляты Staph. aureus показали высокую резистентность к ципрофлоксацину, ампициллину, азитромицину, доксициклину и энрофлоксацину.

Фенотипические исследования детерминант резистентности показали наличие в микробиоценозе различных биотопов определённого количества полирезистентных культур микроорганизмов. Так, от общего количества исследованных культур E. coli, выделенных из фекалий сельскохозяйственных животных, полирезистентными были 40,4 %. Из проб молока изолировали 20,1 % полирезистентных культур E. coli; Staph. aureus – 13,4 %; Staph. epidermidis – 3,9 %. Из объектов инфраструктуры животноводческих помещений выделены 72,2% полирезистентных культур Staph. aureus и 26,6 % E. сoli.

При анализе генетических элементов резистентности выделенных микроорганизмов к антибиотическим препаратам установлено, что у 88,9 % культур E. coli выявлен ген blaCTX-M, кодирующий собой β-лактамазу расширенного спектра действия. Идентифицированные CTX-M β-лактамазы относились к двум генетически родственным группам CTX-M-14 и CTX-M-15. Указанный ген локализируется как на хромосомах, так и в плазмидах, что может способствовать быстрому и широкому распространению генов blaCTX-M среди микробной популяции E. coli . С учётом того, что продукция β-лактамаз расширенного спектра действия обеспечивает резистентность практически ко всем β-лактамным антибиотикам (пенициллинам, цефалоспоринам), с течением времени указанные антибиотики могут оказаться мало или полностью неэффективными. У 11,43 % культур E. coli был выявлен ген blaOXA-10, который кодирует β-лактамазы класса D, и, в частности, резистентность к цефотаксиму и цефтриаксону.

Обнаружение в культурах E. coli генов blaCTX-M и blaOXA-10, кодирующих бета-лактамазы свидетельствует o присутствии генетической базы для формирования мультирезистентных штаммов, так как распространение указанных генов резистентности в микробиомах сельскохозяйственных животных может привести к значительному снижению терапевтической эффективности β-лактамных антибиотиков, макролидов, линкозамидов при борьбе с инфекционной патологией, обусловленной данными микроорганизмами.

У части культур (6,7 %) E. coli был выявлен ген sul 2, кодирующий резистентность к сульфаниламидным препаратам. У единичных культур E. coli установлено наличие гена tet (A), регулирующего резистентность микроорганизмов к препаратам тетрациклинового ряда.

У 15,5 % выделенных культур P. aeruginosa был выявлен ген aph (3¹)-llb, который обеспечивает резистентность к нескольким антибиотикам, в частности, канамицину A и B, неамицину B и C, бутаразину. У единичных культур P. aeruginosa выявлен ген crp P, который кодирует белок, инактивирующий ципрофлоксацин.

Кроме того, у 4,3 % выделенных культур в генетическом материале был выявлен ген fosA, который придаёт высокий уровень устойчивости P. aeruginosa к фосфомицину. У 8,6 % бактерий указанного вида обнаруживается ген cat B7, кодирующий устойчивость выделенных культур микроорганизмов к хлорамфениколу. У трёх культур P. aeruginosa было детектировано наличие одновременно двух генов эндемических β-лактамаз, цефалоспориназы blaCTX-M-15 и карбапенемазы.

У 33,3 % культур Enterobacter cloacae , был обнаружен ген blaCTX-M и у 44,4 % ген blaOXA-10.

При этом из генов, кодирующих токсины, у 8,19 % культур E. coli был выявлен ген stx 2. В то же время гены вирулентности, кодирующие адгезивные белки E. coli к эндотелиальным клеткам fim A и fim H, были обнаружены у 95,74 и 81,91 % изолятов соответственно, что указывает на относительно высокий потенциал вирулентности изолированных культур E. coli , а также возможность образовывать биоплёнки.

Единичные культуры E. coli показали наличие гена шига-токсин типа 2, который является важным патогенетическим фактором, вызывающим различные инфекционные патологии (диарея, геморрагический колит, отёчная болезнь свиней, дизентерия у телят). Профили резистентности микроорганизмов и гены, кодирующие механизмы устойчивости к антимикробным препаратам и вирулентности, могут служить маркерами при      проведении      комплексного эпизоотического мониторинга, а также при изучении возможных векторов распространения штаммов бактерий, вызывающих инфекционную патологию животных и человека.

Заключение. Проведённый анализ фенотипического профиля антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из различных биотопов сельскохозяйственных животных и технологического оборудования животноводческих объектов, показал достаточно широкий диапазон их реагирования в отношении исследованных фармакологических групп антибиотических препаратов, а именно к аминогликозидам III поколения, полусинтетическим пенициллинам + ингибиторам бета-лактамаз, фторхинолонам, цефалоспоринам I, II и III поколения, пенициллинам, макролидам и тетрациклинам. Схожие результаты были получены рядом авторов, изучавших распространение антибиотикорезистенных изолятов бактерий в популяции крупного рогатого скота, в странах Европейского Союза [12, 14].

Кроме того, показано, что фенотипические детерминант свидетельствуют микробиоценозах определённого полирезистентных,

исследования резистентности o    наличии    в различных биотопов количества относительно тестируемых препаратов культур микроорганизмов. Установлено, что от общего количества исследованных культур E. coli, выделенных из фекалий сельскохозяйственных животных полирезистентными были 40,4 %. Из молока изолировали 20,1 % полирезистентных культур E. coli, 13,4 % Staphylococcus aureus, 3,9 % Staphylococcus epidermidis. Из объектов инфраструктуры животноводческих помещений выделены полирезистентные культуры Staphylococcus aureus (72,2 %) и E. coli (26,6 %).

Анализ генетических детерминант антибиотикорезистентности у выделенных культур E. coli показал, что у подавляющего большинства (69,14 %) обнаружен ген blaCTX-M, кодирующий собой в—лактамазу расширенного спектра действия. Указанную тенденцию относительно бактерий E. coli отмечают многие исследователи [11, 12]. Мы согласны с мнением ряда авторов o том, что продукция в-лактамаз расширенного спектра действия приводит к появлению у микроорганизмов резистентности к подавляющему большинству в-лактамных антибиотиков (пенициллины, цефалоспорины). Можно предположить, что указанные фармакологические группы антибиотиков имеют низкий антибиотикотерапевтический эффект [6, 8].

Также у части культур E. coli были выявлены гены вирулетности кодирующие адгезивные белки E. coli к эндотелиальным клеткам (fimA и fimN). На важную роль генов fimA и fimN в развитии патологических процессов при E. coli -инфекциях указывают некоторые авторы [12, 13].

У ряда культур был обнаружен ген шига-токсина stx 2, который может служить важным этиопатогенетическим фактором при возникновении инфекционной патологии сельскохозяйственных животных, что показано рядом авторов [12, 13, 14].

Финансирование. Работа выполнена в рамках гранта Российского научного фонда (соглашение № 23-26-00118 от 13.01.2023)