Фенотипические особенности свиней в период эмбриогенеза при интеграции гена рилизинг-фактора гормона роста человека

Интеграция чужеродных генов в геном животных может вызывать различные изменения на уровне фенотипа, обусловленные дополнительной экспрессией рекомбинантного продукта. Эти изменения могут проявляться на разных уровнях организации индивидуумов (цитологическом, тканевом, организменном) и в определенной степени влиять на функциональное состояние отдельных систем организма. Так, при введении генов, кодирующих белки гормона роста (рилизинг-фактор, инсулиноподобный фактор и др.) у трансгенных животных выявлена повышенная скорость роста мышечной ткани и увеличение конечной живой массы. Полученные трансгенные мыши с геном гормона роста превосходили по скорости роста своих аналогов в 4 раза и имели вдвое большую живую массу (1).

Несколько позднее были получены трансгенные по генам гормона роста кролики, свиньи и овцы, у которых также наблюдались определенными сдвиги по интенсивности роста и развития (2-4). Однако в отличие от данных, полученных на мышах, у сельскохозяйственных животных соответствующего увеличения скорости роста не отмечено. В частности, живая масса трансгенных свиней была незначительно выше, чем в контроле (5-7). У овец, трансгенных по генам гормона роста и сома-толиберина, несмотря на повышенную концентрацию гормона роста в крови, не выявлено усиления интенсивности роста (8).

В то же время при отсутствии существенной разницы по показателям роста у трансгенных животных отмечены определенные изменения в метаболизме клеток ряда органов и тканей, что выражалось прежде всего в увеличении содержания белка и уменьшении количества жира в тканях (9, 10). При этом исследования по оценке фенотипа трансгенных животных проводили в основном в постнатальный период развития. Однако с точки зрения биологических основ трансгеноза несомненный интерес представляет изучение влияния интеграции чужеродных генов на фенотипические признаки животных в период эмбриогенеза.

В связи с этим в задачу нашей работы входила оценка особенностей пред-плодного и плодного периодов внутриутробного развития свиней, трансгенных по гену рилизинг-фактора гормона роста человека.

дили 0,2 мМ dNTP, 25 пкмоль каждого из праймеров и 1 ед. Taq-полимеразы.

Гистологические препараты исследуемых органов готовили по общепринятой методике. Для фиксации образцов тканей эмбрионов использовали фиксатор Карнуа (абсолютный спирт:хлороформ:ледяная уксусная кислота в соотношении соответственно 6:3:1). Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивали на ДНК по Фёльгену, на суммарные нуклеиновые кислоты (РНК+ДНК) галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсену (12). Относительное содержание ДНК в ядрах клеток рассчитывали по формуле a = (l/ b ) ⋅ S ⋅ 100, где а — относительное содержание ДНК на ядро клетки, b — средняя яркость ядра, S — площадь ядра. Аналогичным образом рассчитывали и относительное содержание суммарных нуклеиновых кислот в клетке. Содержание РНК определяли как разность между относительным содержанием суммарных нуклеиновых кислот и ДНК.

Результаты. По интенсивности роста трансгенных животных и их аналогов в контроле по периодам эмбриогенеза не выявлено существенных различий (табл. 1). В 35-суточном возрасте трансгенные эмбрионы лишь незначительно превосходили по массе таковых в контроле (+2,1 %). У 45-суточных эмбрионов наблюдалась обратная тенденция: живая масса трансгенных особей была меньше, чем интактных (–13,0 %). Во второй половине эмбриогенеза у трансгенных особей повышалась интенсивность роста. Эмбрионы в опыте характеризовались более высокой живой массой и повышенной скоростью роста — соответственно на 0,5 и 15,6 % выше, чем в контроле.

1. Показатели интенсивности роста трансгенных и интактных эмбрионов свиней в различные периоды внутриутробного развития

При исследовании интенсивности роста органов и тканей трансгенных и нетрансгенных свиней в ранний период эмбриогенеза выявлена тенденция к снижению массы внутренних органов в опыте по сравнению с контролем: 45-суточные эмбрионы в опыте уступали по массе органов аналогам в контроле в среднем на 3,7-24,7 %. К концу плодного периода (90 сут) у трансгенных животных масса практически всех органов (за исключением почек и кишечника), наоборот, превосходила таковую у особей в контроле. Разница к контролю по абсолютной массе составляла от 1,1 до 9,5 %; в пересчете на относительную массу (доля от общей массы эмбриона) — от 0,3 до 10,0 %.

По морфометрическим показателям других железистых органов различия между эмбрионами экспериментальных групп также выявлены только в поздний плодный период. В частности, у 90-суточных трансгенных эмбрионов площадь цитоплазмы в клетках поджелудочной железы была больше (+9,6 %), чем у интактных особей; ядерно-цитоплазма-тическое отношение уменьшалось (–13,8 %). Аналогичная тенденция прослеживалась и в клетках щитовидной железы, однако эти изменения были менее выражены (см. табл. 2).

Относительное содержание нуклеиновых кислот в клетках железистых органов эмбрионов в контроле и опыте варьировало в зависимости от места синтеза (органа). Более интенсивный синтез ДНК и РНК был отмечен в клетках печени: относительное содержание ДНК — 15,1-20,8, РНК — 28,6-40,2 ед., что выше аналогичных показателей в поджелудочной и щитовидной железах — соответственно в 1,11-1,32 и 2,40-2,70 раза (табл. 3).

• 3.    Относительное содержание нуклеиновых кислот в органах и железах трансгенных и интактных эмбрионов свиней в различные периоды внутриутробного развития

  Орган, железа	Группа	n	Относительное содержание в клетках, ед.		РНК/ДНК
  			ДНК       1	РНК
  Печень	Опыт Контроль	35-с у т 5 8	о ч н ы е э м б р и о н ы 15,2 ± 0,36 15,1 ± 0,30	41,9 ± 0,66 42,0 ± 0,67	2,76 2,78

45-с у т о ч н ы е э м б р и о н ы

П р и м е ч а н и е. Контроль и опыт — соответственно интактные и трансгенные эмбрионы. Прочерк означает, что исследования не проводили.

Следует отметить, что у трансгенных эмбрионов во всех исследованных органах на фоне снижения содержания ДНК наблюдался более интенсивный синтез РНК — на 3-10 % выше по сравнению с контролем. При этом разница по соотношению РНК/ДНК между эмбрионами в контроле и опыте составляла от 3,3 до 25,4 %.

Таким образом, у трансгенных свиней в период эмбриогенеза не наблюдается существенных изменений по интенсивности роста по сравнению с интактными особями. Вместе с тем следует отметить повышенную скорость роста и увеличение массы внутренних органов у трансгенных эмбрионов в поздний плодный период. При этом наличие чужеродного гена, в частности рилизинг-фактора гормона роста человека, оказывает влияние на характер синтеза нуклеиновых кислот в клетке. У трансгенных эмбрионов в отличие от интактных на фоне снижения содержания ДНК повышается содержание РНК в клетках, что в свою очередь оказывает влияние на структурно-функциональные особенности железистых органов. Это выражается прежде всего в увеличении площади цитоплазмы и повышении плотности расположения клеток в эпителиальных слоях железистых органов. Выявленные изменения в клеточной структуре железистых органов трансгенных животных свидетельствуют, на наш взгляд, о более интенсивных процессах специализации тканей, связанных с дополнительным синтезом чужеродного белка в организме генетически модифицированных животных.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    P a l m i t e r R., B r i n s t e r R., H a m m e r R. e.a. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes. Nature, 1982 300: 611-615.

• 2.    H a m m e r R.E., P u r s e l V.G., R e x r o a d Jr. e.a. Production of transgenic rabbit, sheep and pigs by microinjection. Nature, 1985, 315: 680-683.

• 3.    P u r s e l V., C a m b e l l R., M i l l e r K. e.a. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene. J. Anim. Sci., 1988, 66: 267.

• 4.    M u r r a y J.D., N a n c a r r o w C.D., M a r s h a l l J.T. e.a. Production of transgenic merino sheep by microinjection of metallotionein bovine growing hormone fusion genes. J. Reprod. Fertil. Dev., 1989, 1: 147-155.

• 5.    V i z e P.D., M i c h a l s k a A.E., A s h m a n R. e.a. Introduction of a porcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promotes growth. J. of Cell Science, 1988, 90: 295-300.

• 6.    E b e r t K.M., L o w M.J., O v e r s t r o m E.W e.a. Porcine growth hormone gene expression from viral promotors in transgenic swine. Animal Biotechnology, 1990, 1: 145-159.

• 7.    Э р н с т Л.К., Г о л ь д м а н И.Л., К а д у л и н С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца. Биотехнология, 1993, 5: 2-14.

• 8.    R e x r o a d C.E., H a m m e r R.E., B e h r i n g e r R.R. e.a. Insertion, expression and phisiology of growth-regulating genes. J. Reprod. Pert. Suppl., 1990, 41: 19-124.

• 9.    P u r s e l V.G., P i n k e r t C.A., M i l l e r K.F. e.a. Genetic engineering of livestock. Science, 1989, 244: 1281-1288.

• 10.    W i e g h a r t M., H o o v e r J.L, M c G r a n e M.M. e.a. Production of transgenic pigs harbouring a rat phosphoenolpyruvate carboxykinase-bovine growth hormone fusion gene. J. of Reproduction and Fertility, 1990, 41: 89-96.

• 11.    З и н о в ь е в а Н.А., П о п о в А.Н., Э р н с т Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998.

• 12.    Микроскопическая техника. Руководство /Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. М., 1996.

Всероссийский государственный НИИ животноводства ,