Ферментативная активность бактерий из рода Bacillus при гидролизе крахмалсодержащего растительного сырья

Введение. В нашей стране и за рубежом для производства препаратов, обладающих пробиотическими свойствами, широко использовались микроорганизмы из семейств Lactobacillus и Bifidobacterium , а также спорообразующие бактерии из рода Bacillus .

Выявленная способность спорообразующих бактерий оказывать пробиотический эффект привела к разработке препаратов, отнесенных к поколению «самоэлиминирующихся антагонистов», т. е. бактерий, не являющихся постоянными обитателями пищеварительного тракта и быстро выводящиеся (элиминирующиеся) из организма. На основе спорообразующих бактерий в настоящее время в мире создано более пятидесяти препаратов, обладающих пробиотическими свойствами. В Российской Федерации на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus разработаны более двадцати пробиотических препаратов, широко используемых в том числе и в ветеринарной медицине [1]. Пробиотические пре- параты данной группы представляют собой различные штаммы живых бактерий рода Bacillus subtilis, которые подвергаются лиофилизации и представляют собой сыпучую взвесь или могут быть в жидкой форме, являясь по сути культуральной жидкостью с микроорганизмами. Микроорганизмы проявляют устойчивость к антибиотикам и обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к энтеропатогенным бактериям. Пробиотики, изготовленные на основе бактерий рода Bacillus subtilis, используют при дисбактериозе различной этиологии, а также после антибиотикотерапии с целью нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

На основе применения Bac. subtilis якутскими учеными разработан препарат «Сахабактисуб-тил», который кроме лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний рекомендовано применять для коррекции микробиоценоза гениталий у коров.

В последнее время в ряде пробиотических препаратов кроме Bacillus subtilis стали использовать другие виды бацилл. Например, в препарате «Бактисубтил» (Франция) действующим веществом являются споры Bacillus cereus , а пробиотики «БиоПлюс» (Германия) и «Биоспо-рин» (Россия) в своем составе содержат живые лиофилизированные клетки спорообразующих бактерий Bacillus licheniformis .

Представители рода Bacillus способны активно продуцировать целый ряд ферментов, расщепляющих крахмал, целлюлозу, белки, жиры [2], что определяет широкий спектр их биологической активности.

Установлено, что амилазная активность микробов является результатом сложного преобразования генетической программы клетки [3]. При этом основным фактором, подтверждающим способность микроорганизмов подвергать гидролизу крахмал, является экспериментальное обнаружение амилазной активности, а не наличие в его геноме гена а-амилазы. Такой подход предопределяет приоритет функциональной активности амилолитических ферментов над их генетической детерминантой и обуславливает важность разработки методов исследования оценки выработки амилаз микробными клетками рода Bacillus [4].

Цель исследования: изучение сравнительной амилолитической активности у различных видов бацилл из рода Bacillus .

Задача иследования: изучение амилолитической активности у Bacillus subtilis , Bacillus cereus, Bacillus licheniformis , а также установление числа спор у данных видов микроорганизмов, проявляющих максимальный амилолитический эффект.

Материал и методы исследования. Исследование выполнено в условиях научнопроизводственной лаборатории «Биотехнология кормовых добавок» кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины, а также в научно-исследовательском испытательном центре (НИИЦ) Красноярского ГАУ. Амилолитическую активность изучали у трех видов бацилл: Bacillus subtilis, Bacillus ce reus и Bacillus licheniformis. Микроорганизмы выделены и идентифицированы до вида из предоставленного материала в ФГУП ГосНИИ Генетика (Москва). Было установлено, что все виды бацилл продуцировали амилолитический фермент, при этом уровень амилолитической активности каждого вида бацилл не был установлен.

Из изученных микроорганизмов нами используется Bacillus subtilis . На основе его использования разрабатывается технология получения из зернового сырья кормовой добавки для молодняка сельскохозяйственных животных в виде сахаросодержащего продукта, обладающего пробиотическими свойствами. Добавка содержит в своем составе до 70 % сахаров. Ранее установлено, что введение ее в рацион телят увеличивает привесы и повышает сохранность. Сохранность телят связана с лечебнопрофилактическим действием, обусловленным наличием в добавке Bacillus subtilis , которая также продуцирует амилолитический фермент, расщепляющий сложенные сахара до простых, и обладает антагонистической активностью в отношении ряда энтеропатогенных микроорганизмов [5].

Тестирование амилолитической активности Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis проводили согласно методике, представленной в [6], в нашей модификации. Для этого в чашки Петри наливали горячую питательную среду, состоящую из 1,5 %-го агар-агара и 1 %-го крахмального клейстера. На застывшую поверхность накапывали по капле культуральной жидкости Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis. Чашки Петри помещали в термостат на 24 ч при температуре 39 °С. На следующий день чашки извлекали из термостата и наливали на поверхность среды раствор Люголя, разведенный дистиллированной водой в соотношении 1 : 10. Медленным покачиванием распределяли раствор Люголя по всей поверхности плотной питательной среды. Избыток раствора Люголя сливали. Среда приобретала темно-синий цвет за исключением тех зон, где под действием фермента крахмал расщепился. Амилолитическую активность каждого вида бацилл оценивали по величине диаметра зоны обесцвечивания йода вокруг капель.

Контрольной пробой служила чашка Петри с плотной питательной средой и йодом, но вместо культуральной жидкости вносили каплю дистиллированной воды.

Споры бацилл были получены в условиях научно-производственной лаборатории кафедры «Биотехнология кормовых добавок».

Подсчет числа спор Bacillus subtilis , Bacillus cereus , Bacillus licheniformis , содержащихся в культуральных жидкостях, проводили согласно методике, изложенной в [7], с применением счетной камеры Горяева.

Все исследования проводили с 3-кратной повторяемостью для получения статистически достоверных результатов.

Микроскопию мазков и микрофотосъемку изучаемого материала проводили при помощи микроскопа Levenhuk с тринокулярной насадкой и цифровой камеры к нему, с выводом изображения на монитор. Достоверность полученных результатов определялась при помощи программы Statistica и уровня достоверности различий.

Результаты исследования. В контрольных чашках Петри вокруг капель дистиллированной воды не наблюдали зон обесцвечивания йода.

Данные по изучению амилолитической активности различных видов бацилл представлены на рисунках 1, 2 и в таблице.

Рис. 1. Зоны обесцвечивания йода различными видами бацилл: 1 – Bacillus cereus; 2 – Bacillus licheniformis; 3 – Bacillus subtilis

к 50 000 спор/мл 75 000 спор/мл 100 000       125 000       150 000

спор/мл      спор/мл      спор/мл

Диаметр зон обесцвечивания йода, мм;

Диаметр зон обесцвечивания йода, мм;

Диаметр зон обесцвечивания йода, мм;

Рис. 2. Зависимость диаметра зон обесцвечивания йода от количества спор в 1 мл культуральной жидкости

Зоны обесцвечивания йода вокруг капель культуральной жидкости у разных видов бацилл имели различный диаметр, что говорит о различной амилолитической активности фермента, продуцируемого Bacillus cereus , Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis .

Результаты измерения диаметров зон обесцвечивания крахмала вокруг капель культуральной жидкости в зависимости от количества содержащихся в них спор бацилл представлены в таблице.

Размер диаметра зон обесцвечивания йода у разных видов бацилл

Кол-во внесенных спор, спор/мл	Диаметр зон обесцвечивания йода, мм
	Bac. subtilis	Bac. licheniformis	Bac. cereus
50 000	8±0,5	6±0,4	4,8±0,7
75 000	15±0,8	12,6±0,5	10,5±0,6
100 000	19,8±0,8	17±0,6	14,8±0,9
125 000	21,6±0,5	18,2±0,9	16,6±1,8
150 000	21,6±0,5	18,2±0,9	16,6±1,8

Как следует из данных, представленных в таблице, максимальные зоны обесцвечивания йода были у всех изучаемых видов бацилл при содержании в 1 мл культуральной жидкости 125 000 спор. Наибольший диаметр зоны обесцвечивания йода был у Bacillus subtilis , он составил 21,6±0,5 мм. Несколько меньший диаметр зоны обесцвечивания йода был у Bacillus licheniformis , а наименьший диаметр зоны обесцвечивания йода – у Bacillus cereus .

Несмотря на то, что диаметр зоны обесцвечивания йода у Bacillus licheniformis был несколько больше, чем у Bacillus cereus , эти различия были не достоверны (p ≥ 0,05), а вот различия в диаметре зоны обесцвечивания у Bacillus subtilis были достоверно больше, чем у других видов бацилл (р ≤ 0,05).

Диаметр зоны обесцвечивания у всех видов бацилл коррелировал с количеством спор, имевшихся в капле, т. е. чем больше спор было в капле культуральной жидкости, тем больше был диаметр зоны обесцвечивания йода.

Зависимость диаметра зон обесцвечивания йода от количества спор, содержащихся в 1 мл культуральной жидкости у разных видов бацилл, представлена на графике рисунка 2.

Представленные результаты свидетельствуют, что по мере увеличения количества спор увеличивается и зона обесцвечивания йода.

Максимальные диаметры зон обесцвечивания йода, определяющие максимальную амилолитическую активность у изучаемых видов бацилл, были установлены в количестве 125 000 спор/мл. При этом у Bacillus cereus диаметр зоны обесцвечивания составил 16,6±1,8 мм; у Bacillus licheniformis – 18,2±0,9; а у Bacillus subtilis – 21,6±0,5 мм.

Дальнейшее возрастание числа вносимых спор у всех видов бацилл, превышающих 125 000 спор на 1 мл, не приводило к увеличению зоны обесцвечивания йода.

Выводы

• 1.    По степени ферментативной (амилолитической) активности бациллы располагались в следующем убывающем порядке:   Bacillus

• 2.    Число спор, дающих максимальный амилолитический эффект у Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis и Bacillus cereus , составило 125 000 спор/мл.

subtilis , затем Bacillus licheniformis и наименьшая амилолитическая активность определялась у Bacillus cereus .