Ферментативная конверсия как способ получения биологически активных пептидов

Современный рынок пищевых продуктов демонстрирует стабильный рост разработки и получения продуктов с использованием пищевых ингредиентов, обладающих различными биологическими эффектами. В качестве таких ингредиентов могут служить белки молока и их отдельные фракции, обладающие антиоксидантными, гипотензивными, иммуномодулирующими, гипохолестеремическими и другими биологическими эффектами.

При современном многообразии технологических подходов к получению функциональных ингредиентов выбор конкретного решения обусловлен поставленной задачей. В обзоре представлены основные подходы и пути регулирования тех или иных биологических эффектов.

Результаты и обсуждение

Белок в пищевом продукте выполняет две основные функции – структурную и пищевую. Его способность проявлять те или иные структурные функции (способность к быстрому растворению, гелеобразованию, пенообразованию) может быть охарактеризована так называемыми функциональными свойствами (ФС), которые определяются на основе поведения белка в системах, моделирующих реальные пищевые продукты или пищевые системы. Основными методами регулирования функциональных свойств белка (ФСБ) можно считать химические, физико-химические, ферментативные и др. [1].

Химическая обработка белков молока связана с воздействием на них различных реагентов, а именно: минеральные кислоты, щелочи и др. Однако такая гидролитическая обработка белка имеет ряд недостатков. Так, при щелочном гидролизе происходит разрушение таких аминокислот, как цистин, лизин, аргинин, серин, цистеин и образуются труднорастворимые комплексы, которые негативно влияют на пищевые свойства гидролизатов [2]. Что касается кислотного гидролиза, он имеет повышенные трудозатраты, так как возникает необходимость введения щелочей для нейтрализации кислотности, в результате чего образуются нежелательные соли, и происходят значительные потери незаменимых аминокислот [3]. Ферментативный же гидролиз, в отличие от вышеперечисленных, способен обеспечить максимально возможное сохранение питательной ценности и в итоге получить продукт с требуемой степенью гидролиза. При этом стоит учитывать, что ферменты обладают высокой избирательной способностью, поэтому необходим их предварительный подбор для осуществления направленного гидролитического воздействия на определенные химические связи в молекулах белка [2; 3].

Исследовательские работы доказывают, что гидролизаты молочных белков находят применение при производстве различных продуктов, в том числе детского и спортивного питания, низкоаллергенных и т. д. [4]. Наиболее интересным и востребованным является использование гидролизатов для создания функциональных продуктов массового потребления. Свойства, определяющие назначение гидролизатов, зависят в первую очередь от степени гидролиза (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики пептидных композиций из молочных белков в зависимости от их назначения

Table 1. Characteristics of peptide compositions from milk proteins depending on their function

Тип пептидной композиции	Степень гидролиза, %	Назначение	Молекулярная масса компонентов, Да
Мало гидролизованная	до 5	Технологические добавки – пенообразователи, эмульгаторы	> 8000
Средне гидролизованная	5–20	Функциональные продукты с пониженной аллергенностью, специализированные пищевые продукты для лечебного и спортивного питания	3000–10000, минимальное содержание свободных аминокислот
Глубоко гидролизованная	20–50	Гипоаллергенные пищевые продукты	< 3000
		Продукты для зондового питания	< 1000, 15–20 % свободных аминокислот
Очень глубоко гидролизованная	> 80 %	Смеси для парентерального питания	< 500, преобладание свободных аминокислот

Так, в спортивном питании и медицине применяются гидролизаты, содержащие от 15 до 20 % свободных аминокислот, ди-, три- и олигопептиды с молекулярной массой до 3000 Да [4]. Для парентерального и внутривенного питания используются инфузионные растворы на основе индивидуальных аминокислот [2]. При проведении диетотерапии и в продуктах для детского питания важным моментом является полное устранение аллергенности. Например, для белков коровьего молока гипоаллергенность достигается при снижении молекулярного веса пептидов в гидролизате ниже 2500–3000 Да [2]. Также мало гидролизованные пептидные композиции из белков молока зачастую используются в качестве эмульгаторов и пенообразователей [5].

Очевидным преимуществом ферментативного гидролиза является то, что он в основном проводится при нейтральном рН, умеренных температурах (45–60 °С), что позволяет получать белковые гидролизаты с высокой биологической ценностью, поскольку полностью сохраняются термолабильные незаменимые аминокислоты (лизин, лейцин, аспарагиновая кислота, метионин, триптофан, цистеин и тирозин), не наблюдается выраженной рацемизации аминокислот и образования трудноусваиваемых циклических пептидов и дикетопиперазинов [2; 5].

Наряду с вышеперечисленными преимуществами во время ферментативного катализа высвобождаются пептиды и свободные аминокислоты (САК), которые влияют на вкусовые характеристики конечного продукта, а именно появляется горьковатый привкус или послевкусие [6]. Поэтому ферментные препараты должны подбираться таким образом, чтобы минимизировать количество САК при гидролизе. Помимо отрицательного влияния на органолептические свойства белковых гидролизатов, высокое содержание САК приводит к снижению их биологической ценности, так как скорость всасывания свободных аминокислот в тонком кишечнике человека значительно ниже, чем олигопептидов [6–8]. Исходя из этого, были проанализированы данные по субстратной специфичности протеолитических ферментных препаратов, используемых для гидролиза молочных белков [2; 5] (табл. 2).

В целом, стратегии получения белковых гидролизатов с заданными биофункциональными свойствами можно разделить на две основные группы [2; 5]:

• –    использование ферментных препаратов с достаточно широкой субстратной специфичностью – хаотичное расщепление пептидных связей в молекуле белка, при этом предугадать уровень придания тех или иных свойств не представляется возможным;

• –    направленный гидролиз белка с использованием данных о структуре исходного белкового сырья и специфичности протеолитических ферментов по отношению к расщепляемой пептидной связи.

Во втором случае появляется возможность прогнозирования последовательностей пептидов, отвечающих за определенные биофункциональные свойства гидролизатов, а также возможность их регулирования за счет направленного подбора ферментов с определенной субстратной специфичностью, и следовательно, производства на их основе функциональных продуктов [2; 4; 5].

Таблица 2. Специфичность протеолитических ферментов и ферментных препаратов по отношению к расщепляемой пептидной связи

Table 2. Specificity of proteolytic ferments and enzymatic preparations relating to split peptide link

Государственная политика в области здорового питания в качестве основных задач ставит перед исследователями "развитие производств пищевых продуктов, обогащенных незаменимыми компонентами" и "продуктов функционального назначения, диетических (лечебных и профилактических) пищевых продуктов".

Условно, все функциональные продукты можно разделить на три группы: первая группа – "привносят хорошее", например, улучшают работу желудочно-кишечного тракта (пре- и пробиотики), вторая группа – способствуют коррекции различных патологий (способствуют снижению уровня артериального давления или холестерина), третья группа – не содержат определенных соединений, например без лактозы, без глютена и т. д. Основная масса ранее разработанных функциональных продуктов была обогащена витаминами и/или минеральными веществами. В дальнейшем стали разрабатываться продукты, обогащенные другими микронутриентами, такими как жирные кислоты, омега-3, растворимые пищевые волокна. В последнее время ведущие мировые компании приступили к активной разработке продуктов, оказывающих различные положительные эффекты на физиологическое состояние организма – "здоровье в одном продукте" [4; 5].

Анализ работ в области создания функциональных продуктов свидетельствует об активном развитии направления переработки протеиносодержащего молочного сырья для получения белковых композиций с последующим созданием на их основе продуктов. Многими исследователями доказано, что гидролизаты молочных белков способны снижать кровяное давление путем ингибирования ангиотензин-I-превращающего фермента (АПФ) короткими олигопептидами. При ингибировании АПФ снижается продукция ангиотензина II, обладающего мощным сосудосуживающим действием, увеличивается концентрация брадикинина и оксида азота (II), которые обладают сосудорасширяющим действием. Источниками АПФ-ингибирующих пептидов могут служить как пищевые продукты, непосредственно содержащие гидролизаты молочных белков (детские молочные смеси), так и ферментированные кисломолочные продукты (творог, кефир, йогурт и др.) и сыры [9–11]. Основные АПФ-ингибирующие пептиды, идентифицированные зарубежными и российскими специалистами как в гидролизатах молочных белков, так и ферментированных молочных продуктах, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Пептиды, ингибирующие АПФ, идентифицированные в гидролизатах молочных белков и ферментированных молочных продуктах

Table 3. ACF-inhibiting peptides identified in milk protein hydrolysates and fermented milk products

Белок-предшественник	Источник	Последовательности пептидов
Овечий β-казеин	Сыр Manchego	VRGPFP
Овечий β-казеин	Сыр	YQEPVLGP
Бычий β-казеин	Сыр Чеддэр	YQEPVLGPVRGPFPILV
Бычий β-лактоглобулин	Гипоаллергенные молочные смеси на основе гидролизатов сывороточных белков и казеина	LKP, ALPNV, PGPIHN, YVEEL, VAGTWY, LDAQSAPLR
Бычий β-казеин		YP
Бычий κ-казеин		YP, EIPT
Бычий αs1-казеин		YP
Бычий αs2-казеин		IPY
Бычий β-казеин	Кисломолочный напиток с закваской Lactobacillus helveticus, 44 образца твердых, полутвердых и мягких сортов сыра	IPP, VPP
Бычий β-лактоглобулин	Гидролизат β-лактоглобулина	IDALNENK, ALPMHIR, GLDIQK, TKIPAVFK, VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR
Бычий β-лактоглобулин	Антигипертензивный йогурт	LF, YL, LLF, LVR, ALPMH
Бычий β-казеин		FP, YP, LY, VRGPFPIIV, VPP, IPP, LPLP, IHPF, RDMPIQAF, AQTQSL, VLPQ, LNVPGEIVE, LHLPLP, EMPFPK, RGPFPIIV, YQEPVL, DKIHPF, KVLPVPQ, VLPVPQK, RELEEL, VPPFLQP, NVPGEIVE, NIPPLTQTPV, VYPFPGPIPN, TPVVVPPFLQP, LTQTPVVVPPF, LVYPFPGPIPNSLPQ, YQEPVLGPVRGPFPIIV, NIPPLTQTPVVVPPFLQP
Бычий κ-казеин		YP, PPK, VTSTAV
Бычий αs1-казеин		YP, YL, FF, LW, LPQ, PLW, FVAP, TTMPLW, AYFYPE, RPKHPIK, KTTMPLW, RPKHPIKHQGLPQ
Бычий αs2-казеин		YL, TKV, KFALPQ, ALNEINQFY
Бычий α-лактальбумин		LF, IW, WL, EW, YGL, WLAHK
Бычий казеин	in silico	KVLILA
Овечий αs2-казеин	Овечий сыр типа Идиазабал	PRKEKLCTTS, NAGPFTPTVNREQLSTS
Овечий β-казеин		YQEPVLGPVRG
Овечий β-лактоглобулин		KALPMHIRLAF
Овечий сывороточный альбумин		QNALIVRYTR, EGPKLVAS, KVGTKCCAKP, REKVLASS, PKIDAMREKVLA
Бычий α-лактальбумин	Гидролизаты α-лактальбумин	YG, LF, YGL, YGFL, WLAHK, VGYNYWLAHK
Бычий αs2-казеин	Пробиотический йогурт	TYLEE
Бычий κ-казеин		IPP, ARHPH
Бычий β-казеин		IPP, YQEPVL, RINKK, SLPQN, VPP
Бычий β-казеин	Молоко, ферментированное Enterococcus faecalis	VLGPVRGPFP, VVVPPF, LHLPLP, LTQTPVVVPPF, VRGPFPII, LHLPLPL, LVYPFPGPIPNSLPQNIPP, VLGPPVRGPFPIIV
Бычий β-казеин	in silico	FP
Бычий β-лактоглобулин		IPA
β-микроглобулин		GKP
Бычий β-лактоглобулин	Гидролизат β-лактоглобулин трипсином	PEVDDEA

Одними из первых АПФ-ингибирующих пептидов, содержащихся в кисломолочных напитках, идентифицированы трипептиды VPP и IPP. Их гипотензивный эффект был доказан в экспериментах in vitro, in vivo на крысах со спонтанной гипертензией линии SHR (spontaneously hypertensive rats), а также клинических испытаниях на пациентах с умеренной артериальной гипертензией [9; 12]. При этом доказано, что данные трипептиды устойчивы к перевариванию в желудочно-кишечном тракте. При дальнейших исследованиях АПФ-ингибирующие пептиды VPP и IPP были идентифицированы в составе функционального антигипертензивного йогурта, пробиотического йогурта и различных мягких, твердых и полутвердых сырах. Основываясь на данных табл. 3, стоит отметить, что источниками АПФ-ингибирующих пептидов в молочных продуктах могут выступать как казеины, так и сывороточные белки, а длина соответствующих биологически активных пептидов, как правило, не превышает десяти аминокислотных остатков. При этом белками-предшественниками для большинства идентифицированных АПФ-ингибирующих пептидов, входящих в состав молочных продуктов, являются β-казеины и β-лактоглобулин. Величина гипотензивного эффекта молочных продуктов, как считают, зависит от технологических условий их получения, определяющих в свою очередь качественный и количественный состав пептидных профилей продуктов [10–12].

Помимо АПФ-ингибирующих пептидов в молочных белковых гидролизатах были обнаружены короткие пептиды, обладающие цитопротекторным и иммуномодулирующим действием [13]. Среди пищевых источников иммуномодулирующих пептидов основной объем исследований посвящен гидролизатам белков молока, а также пептидам, выделенным из ферментированных молочных продуктов (сыры, кисломолочные продукты) и молозива [2].

Для большого числа пептидов, входящих в состав гидролизатов молочных белков и ферментированных молочных продуктов, выявлено наличие антиоксидантной активности по отношению к различным радикалам и в системах с окислением липидов (табл. 4). Основными механизмами антиоксидантного действия пептидов и аминокислот является прямое гашение свободных радикалов, связывание ионов металлов переменных валентностей, рециклинг восстановленных форм металлов переменных валентностей. Прямое гашение основано на восстановлении свободных радикалов антиоксидантами, приводящее к образованию продуктов, которые не могут поддерживать развитие радикально-цепных реакций. Связывание ионов металлов переменных валентностей, в основном ионов меди и железа, в устойчивые комплексы позволяет предотвратить их участие в реакциях перекисного окисления липидов в пищевых матрицах и биологических системах. С другой стороны, пептидные антиоксиданты могут также проявлять про-оксидантный эффект, который чаще всего обусловлен восстановлением ионов металлов переменных валентностей с последующим их участием в реакциях перекисного окисления [14].

Таблица 4. Антиоксидантные пептиды, идентифицированные в гидролизатах молочных белков и ферментированных молочных продуктах

Table 4. Antioxidant peptides identified in milk protein hydrolysates and fermented milk products

Источник	Последовательности пептидов
Гидролизат коровьего казеина	YVL, YFYPEL, IQY, FALPQYLK, PYVRYL
Гидролизат овечьего казеина	YIPIQ, YAKPVA, SRYPSY, HPHPHLSF, YQQRPAVL, PTVHSTPTTE, WQVLPNAVPAK, INNQFLPYPY
Гидролизат белков сыворотки молока	MHIRL, WYSLAMAASDI, YVEEL
Синтетические аналоги антиоксидантных пептидов, идентифицированных в гидролизате β-лактоглобулина	WY, WYS, WYSL, WYSLA, WYSLAM, SALAM, WYSLAMA
Ферментированное молоко	HLPLPL, AKYIPIQYVLSRYPSY, IPIQYVL
Антигипертензивный йогурт	ARHPHPHLSFM, VLPVPQK, HLPLPL
Гипоаллергенные молочные смеси на основе гидролизатов сывороточных белков и казеина	YVEEL
Сыр Рокфор	KEMPFPKYPVE, YQEPVLGPVRGPFPI

Длина большинства антиоксидантных пептидов, идентифицированных в молочных продуктах, находится в пределах от 2 до 15 аминокислотных остатков, что соответствует диапазону молекулярных масс от 0,24 до 1,80 кДа (табл. 4). При этом ключевыми белками-предшественниками антиоксидантных пептидов, обнаруженных в молочных продуктах, являются κ- и β-казеины и β-лактоглобулин [15; 16].

С увеличением длины пептида возрастает вероятность образования элементов вторичной структуры, что приводит к возникновению стерических препятствий для взаимодействия гидрофобных аминокислот, например триптофана, со свободными радикалами. При уменьшении длины пептидов снижается интенсивность влияния аминокислотных остатков друг на друга. Помимо этого, пептиды молочных белков обладают более высокой антиоксидантной емкостью по сравнению с эквивалентной смесью свободных аминокислот [14].

Наличие остатков редокс-активных аминокислот (С, Н, Y, W и M) является важным структурным дескриптором антиоксидантных пептидов, а наличие остатков гидрофобных аминокислот повышает антиоксидантные свойства пептидов в системах, содержащих липидную фазу. Аминокислоты с ионогенными группами в боковых радикалах ответственны за связывание ионов металлов переменных валентностей, а наличие у гидролизатов молочных белков антиоксидантных свойств позволяет использовать их не только в качестве функциональных ингредиентов, но и технологических добавок для снижения интенсивности процессов перекисного окисления липидов и увеличения сроков хранения пищевых продуктов [14].

Заключение

Результаты проведенного информационного анализа свидетельствуют о перспективности использования направленного ферментативного гидролиза молочного сырья с целью получения пептидных композиций с заданными биологическими свойствами. Для белковых гидролизатов, полученных из молочного сырья, в том числе и молочной сыворотки, описаны различные типы биологических активностей, среди которых гипотензивное и антиоксидантное действие в литературе упоминается наиболее часто. Добиться максимального выхода биологически активных пептидов, а также регулирования их биологических свойств возможно путем направленной биокаталитической конверсии с использованием данных о структуре исходного белкового субстрата и подбора ферментов с определенной специфичностью по отношению к расщепляемой пептидной связи. Таким образом, весьма перспективно использовать гидролизаты молочных белков при разработке новых функциональных продуктов.