Ферментативный гидролиз мясных белков протеазами различного происхождения

Растущий спрос на белок в мировом масштабе диктует мясоперерабатывающей отрасли новые требования. Для переработки побочных и низкосортных мясопродуктов в более востребованные продукты на рынке необходимы новые методы их переработки. Эффективную переработку побочных продуктов мясной отрасли можно проводить путем ферментативного гидролиза белкового компонента, что позволит повысить его пищевую ценность. Протеолитические ферменты составляют одну из наиболее важных групп коммерческих ферментов, которые широко используются в промышленных процессах [3]. Многие ферменты представляют интерес для гидролиза мясных белков (папаин, Алкалаза®, Протамекс®, Flavourzyme®, Нейтраза®, Протозим С и др.).

Ферменты микробного происхождения также применяются для гидролиза мясного сырья. По сравнению с ферментами животного или растительного происхождения микробные ферменты обладают рядом преимуществ, включая широкий спектр каталитических активностей, более высокий pH и температурную стабильность [4].

Химический гидролиз белков, который достигается за счет расщепления пептидных связей кислотой или основанием, является одним из самым недорогих способов получения гидролизатов. Однако есть множество ограничений для пищевого сырья при использовании данного метода. Химический гидролиз, несмотря на дешевизну, представляет собой сложный технологический процесс с применением сильнодействующих кислот и оснований, происходящий при экстремальных температурах и pH. Полученные таким образом гидролизаты обычно обладают пониженной биологической ценностью, плохими функциональными свойствами и низкими вкусовыми качествами [2].

Кислотный гидролиз белков используется чаще, чем щелочной гидролиз. Хотя этот процесс сложен и его трудно контролировать, он по-прежнему является предпочтительным методом для получения гидролизатов. Кислотный гидролиз мясного белка обычно включает реакцию белков с соляной кислотой или, в некоторых случаях, с серной кислотой. Белки полностью гидролизуются при высокой температуре и часто под высоким давлением. Во время щелочного гидролиза мясного белка происходит быстрое расщепление белков до крупных водорастворимых полипептидов, за которым следует дальнейшая деградация с более медленной скоростью распада на аминокислоты. Кроме того, как для кислотного, так и щелочного гидролиза необходима нейтрализация, в результате которой образуется большое количество соли, что также усложняет дальнейшие технологические операции и ухудшает качество готового гидролизата.

Ферменты микробного происхождения используются во многих сферах пищевой промышленности. Применение микробных ферментов позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшить качество готовой продукции, увеличить ее выход, сэкономить ценное пищевое сырье, так как их применение позволяет ускорить одновременно несколько технологических процессов. Ферментный гидролиз является более перспективным и эффективным методом обработки мясного сырья [5, 6].

Цель данного исследования – оценка влияния ферментных препаратов (микробного и животного происхождения) на гидролиз белков говядины II сорта.

Материалы и методы исследований

Объекты исследования:

• –    говядина II сорта;

• –    Протозим С® - щелочная грибная протеаза (продуцент - Acremoniumchrysogenum ), (производство компании «Энзим», г. Львов);

• –    Flavourzyme®1000 L - комплекс грибной протеазы, полученной при культивировании штамма Aspergillusoryzae , обладает как эндопептидазной, так и экзопептидазной активностью (производство компании Novozymes (Дания));

• –    Протепсин® – энзимный препарат животной природы (ООО «Завод эндокринных ферментов», п. Ржавки, Московская область).

Мясное сырье сначала измельчали в блендере Bosch®, а затем нагревали при температуре 85 °C в течение 20 мин для инактивации эндогенных ферментов. Для получения мясной эмульсии приготовленное сырье смешивали с дистиллированной водой 1:2 и гомогенизировали в смесителе Bosch® в течение примерно 2 мин при комнатной температуре. Условия гидролиза в зависимости от вида фермента представлены в таблице 1.

Процесс гидролиза проводили в стеклянных колбах объемом 250 мл на встряхиваемой водяной бане при постоянном перемешивании (200 об./мин). По истечении времени гидролиза полученные гидролизаты нагревали до 95 °С и выдерживали 20 мин для инактивации фермента.

Белок в исследуемых образцах определяли методом Кьельдаля. Содержание белка в гидролизате выражали в процентах к белку в исходной смеси. Все эксперименты проводились в трехкратной повторяемости [1].

Степень гидролиза белка (СГ) (%), определяли по формуле:

СГ =

^NAA^-NAAO ⁿoa^-naao’

где N OA – содержание общего азота, %; N AAO – содержание аминного азота в негидролизованном сырье, %; N AA – содержание аминного азота в гидролизате, %.

Результаты исследований и их обсуждение

На первом этапе исследований подбирали условия гидролиза субстрата – мясной эмульсии.

При выборе ферментного препарата для гидролиза того или иного субстрата важно определить оптимальные условия ведения процесса ферментации. В настоящем исследовании для гидролиза принято мясное сырье, которое отличается многокомпонентностью как самого сырья, так и белковой фракции [7-9].

В настоящее время в мясной отрасли широко используются различные пищевые добавки и технологические вспомогательные вещества для улучшения свойств сырья и повышения потребительских показателей готового продукта. Следует отметить, что в каждом конкретном случае уточняются условия применения того или иного препарата, хотя они указываются производителем [10-13].

Были изучены наиболее важные факторы, влияющие на ферментативную активность исследуемых препаратов - грибных протеаз протозим С и Flavourzyme 1000 L и фермента животного происхождения протепсина.

На рисунке 1 представлены результаты изучения влияния температуры на активность исследуемых препаратов.

Исследованиями установлено, что активность изучаемых ферментов в разной степени зависит от температуры субстрата. Максимальную активность они проявляют в диапазоне температур от 37 °С для протепсина до 50 °С – для ферментов микробного происхождения. Отмечено, что повышение температуры свыше оптимальных значений приводит к резкому понижению активности микробиальных ферментов по сравнению с ферментом животного происхождения протепсином. Из рисунка 1 видно, что инактивация ферментов начинается при температуре выше 70 °С и при температуре ближе к 80 °С наступает полная инактивация всех ферментных препаратов.

Протепсин       Flavourzyme 1000 L       Протозим С

Рисунок 1 – Влияние температуры на протеолитическую активность ферментов

Другим важным фактором, оказывающим влияние на активность исследуемых протеаз, является pH среды. Известно, что характер среды наряду с ее температурой, приводит не только к денатурационным процессам, но и к конформационным изменениям в активном центре ферментов [14 - 16].

На рисунке 2 представлены результаты исследования влияния pH-среды на протеолитическую активность ферментных препаратов.

Протепсин      Flavourzyme 1000 L      Протозим С

Рисунок 2 – Влияние рН на протеолитическую активность ферментов

Из рисунка видно, что при изменении pH субстрата от 6,0 до 9,0 ферменты проявляют высокую активность. Ферментные препараты микробного происхождения, так же как и при изучении влияния температуры, характеризуются значительно большей активностью, нежели ферменты животного происхождения. Максимальную активность также проявляет протозим С.

Другим важным фактором, влияющим не только на степень действия фермента на субстрат, но и на стоимость процесса, является его концентрация. Производители препаратов, как правило, называют достаточно широкий предел эффективной дозы фермента.

Поэтому на следующем этапе исследований изучили влияние дозы каждого ферментного препарата на эффективность ферментации исследуемой эмульсии. Пределы изменения дозы ферментов были приняты от минимальных значений до максимальных, которые рекомендованы производителями.

Результаты исследований представлены на рисунке 3.

^^Протепсин  ^^Flavourzyme 1000 L  ^^Протозим С

Рисунок 3 – Влияние дозы фермента на степень гидролиза

Данные рисунка 3 показывают, что при использовании в качестве субстрата мясной эмульсии рекомендуемые производителем дозы препаратов имеют незначительные различия. Наибольшую степень гидролиза при минимальной концентрации (0,06 %) обеспечивает фермент протозим С. Дальнейшее повышение концентрации не приводит к заметному повышению степени гидролиза.

Невысокую степень гидролиза обеспечивает фермент Flavourzyme 1000 L . Следует отметить, что степень гидролиза мясной эмульсии данным ферментом более чем в 2 раза ниже по сравнению с протозимом С, хотя доза последнего увеличивается почти на 40 % для обеспечения максимальной степени гидролиза.

Низкую степень гидролиза обнаружил фермент животного происхождения протепсин – лишь 15 %.

Для определения продолжительности гидролиза, обеспечивающей наибольшую степень гидролиза белков, процесс проводили в течение 18 ч.

Результаты исследований представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 – Содержание белка в гидролизе в зависимости от продолжительности гидролиза

Из рисунка 4 видно, что с увеличением продолжительности гидролиза для всех исследуемых ферментных препаратов степень гидролиза повышается. Наибольшие значения данного показателя обнаружены при продолжительности процесса 18 ч.

Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза свыше 18 ч не приводило к существенным изменениям степени гидролиза.

На основании данной серии экспериментов и рекомендации производителей ферментных препаратов были приняты следующие параметры ферментации, которые представлены в таблице.

Таблица

Условия гидролиза в зависимости от вида фермента

Показатель	Ферментный препарат
	Протозим С	Flavourzyme 1000 L	Протепсин
Температура, °C	50	50	37
Величина pH	9	7	6
Доза фермента, %	0,06	0,25	0,1
Продолжительность гидролиза, ч	18	18	18

Результаты изучения изменений содержания белка в гидролизатах через 1, 10 и 18 ч представлены на рисунке 5.

Протозим С            Flavourzyme             Протепсин

Время гидролиза, ч

• ■ 1ч ■ Юч ■ 18 ч

Рисунок 5 – Содержание белка (%) в гидролизате от времени гидролиза

Данные рисунка показывают, что гидролизаты, полученные с применением грибных протеаз, содержат большее количество белка. Максимальное содержание белка в гидролизате, полученном при обработке говядины II сорта протозимом С, составляет 82,54 %. Наименьшее содержание белка наблюдается в образце, обработанном протепсином (61,09 %).

Гидролиз белков говядины II сорта с использованием различных ферментов (микробного и животного происхождения) показал значительные различия по СГ белков и содержанию белков в гидролизате. Гидролизаты, полученные ферментативным путем с применением протозима С, имеют самое высокое содержание белка и СГ. Использование грибных протеаз (протозим С и Flavourzyme 1000 L ) для гидролиза белков дает больше преимуществ в экономическом (стоимость ферментного препарата) и экологическом отношении по сравнению с ферментами животного происхождения и химическим гидролизом.

Результаты исследований показали, что гидролизаты, полученные с применением грибной протеазы протозима С, имеют самое высокое содержание белка (82,54 %) в системе через 18 ч гидролиза. Ферментативный гидролиз мясных белков протеазой животного происхождения (протепсин) имеет самое низкое содержание белка в системе (61,09 %).

Выводы

На основании выполненных исследований установлено, что грибные протеазы проявляют более высокую протеолитическую активность по отношению к белкам мяса, чем протеаза животного происхождения протепсин.

Выявлены оптимальные условия гидролиза мясной эмульсии: грибные протеазы обладают более высокой термоустойчивостью по сравнению с протепсином – 50 °С против 37 °С.

Показано, что грибные протеазы высокую активность проявляют при более высоких значениях рН, чем протеаза животного происхождения: Flavourzyme 1000 L – при рН 7,0, протозим С – при рН 9,0. Максимальную активность протепсин проявляет в слабокислой среде – рН 6,0.

При изучении влияния концентрации фермента на степень гидролиза белков эмульсии обнаружены существенные различия: минимальная доза фермента, при которой обеспечивается максимальная степень гидролиза, составляет для протозима С 0,06 %, Flavourzyme 1000 L – 0,25 %, протепсина – 0,10 %.

При продолжительности гидролиза 18 ч все ферментные препараты проявляют наибольшую степень гидролиза. Максимальное содержание белка обнаружено в гидролизате, полученном при использовании Протозима С.