Ферментные маркёры повреждения канальцев почек при различной степени выраженности нарушениях метаболизма костной ткани у больных гемофилией

E-mail: KlimAG@yandex.ru

ФЕРМЕНТНЫЕ МАРКЁРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ КАНАЛЬЦЕВ ПОЧЕК ПРИ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ НАРУШЕНИЯХ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ

Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

Гемофилия – врождённый геморрагический диатез, характеризующийся рецидивирующими кровотечениями различной локализации. Одно из частых осложнений тяжёлого течения гемофилии – формирование гемофилической нефропатии. Ведущим симптомом поражения почек при гемофилии является рецидивирующая микро- или макрогематурия, которая встречается у 14-30% больных [1]. Гематурия может возникать спонтанно, после перенесённой респираторной инфекции в связи с незначительными травмами поясничной области. Появлению и усилению гематурии способствуют приём нестероидных противовоспалительных средств, массивные трансфузии крови и плазмы. При купировании данного синдрома существенный потенцирующий эффект антигемофилическим препаратам оказывают глюкокортикоиды [1]. Динамическое наблюдение за больными гемофилией свидетельствует, что частота гематурии не всегда соответствует тяжести заболевания. Азотвыделительная функция почек у большинства больных остаётся стабильно нормальной, хотя в некоторых случаях развивается хроническая почечная недостаточность (ХПН) [1,2,3]. С.С. Бес-смельцев и соавт. при ультразвуковом исследовании мочевыделительной системы у больных гемофилией в 90% случаев отмечают признаки хронического пиелонефрита и нефролитиаза [3]. Однако характер поражения почечной ткани и механизмы формирования гемофилической нефропатии остаются неясными.

Диагностические трудности в исследовании почек у больных гемофилией связаны с невозможностью морфологического изучения ткани органа по результатам пункционной биопсии в связи с высокой вероятностью развития тяжёлых геморрагических осложнений.

В этом плане перспективны исследования активности в моче ренальных ферментов. Энзимурия является индикатором поражения почек, указывая на повреждение гломерулярного и тубулярного отделов нефрона задолго до выявления его с помощью традиционных методов диагностики. Патологические процессы, происходящие в различных отделах нефрона, приводят к увеличению проницаемости цитомембран, активации лизосомальных систем клеток, в более тяжёлых случаях к цитолизу, что в свою очередь ведёт к увеличению экскреции с мочой ферментов [5,9,22]. Изучение активности ферментов с различной регионарной и субклеточной локализацией в нефроне позволяет определить топику и степень его повреждения [4], оценить активность и динамику патологического процесса.

Целью настоящего исследования является изучение клинического значения энзимурии у больных гемофилией для уточнения локализации и степени повреждения различных отделов нефрона в сочетании с оценкой основных показателей минерального обмена, а также определение диагностической ценности энзимурии в выявлении ранних признаков поражения почек.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 52 больных с тяжелой формой гемофилии А (уровень VIII фактора 0 – 2 %) и 5 больных гемофилией В (уровень IX фактора 0 – 2 %) в возрасте от 17 до 50 лет. Исследование мочи проводилось вне эпизодов гематурии, у больных не было клиниколабораторных признаков нефротического синдрома. Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц мужского пола в том же возрасте. Нами проведено исследование ферментов мочи с различной клеточной и субклеточной локализацией в нефроне: гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ, КФ 2.3.2.2), щелочной фосфатазы (ЩФ, КФ 3.1.3.1), связанных с плазматической мембраной (щёточной каёмкой) тубулярного эпителия; лейцинаминопептидазы (ЛАП, КФ 3.4.11), находящейся в цитоплазме клеток эпителия проксимального отдела канальцев; лизосомального фермента N-ацетил-b-D-глюкозаминидазы (НАГ, КФ 3.2.1.30), сосредоточенного в эпителии извитой части проксимального отдела нефрона. Определение активности в моче этой группы ферментов позволяет выявлять уровень и глубину поражения тубулярного отдела нефрона. У всех больных определяли концентрацию Са, Р, Мg и мочевой кислоты в моче. Наряду с этим неоднократно проводили общий анализ мочи и определяли скорость клубочковой фильтрации. Активность ферментов определяли в разовой утренней порции мочи: 10 мл центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин и проводили диализ 2 мл супернатанта (1мл мочи против 200 мл физиологического раствора).

Метаболизм костной ткани оценивался по содержанию кальция (Са) и фосфора (Р) в сыворотке крови и моче, о состоянии формирования костной ткани судили по активности костной фракции щелочной фосфатазы в сыворотке крови, об уровне резорбции – по содержанию оксипролина в крови и моче. Все биохимические исследования выполняли с помощью коммерческих тест систем фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия) на автоматическом анализаторе «ВМ/Hitachi 911E». Активность ферментов и концентрацию кальция в моче пересчитывали на 1 ммоль креатинина, содержание которого определяли в утренней порции мочи.

В нашей работе мы использовали двухэнергетическую рентгеновскую денситометрию на аппарате фирмы PRODIGY. Исследование минеральной плотности костной ткани (МПКТ) проводили в поясничном отделе позвоночника и проксимальных отделах бедренных костей. Результаты исследований МПКТ оценивались согласно рекомендациям ВОЗ по Т-критерию у больных старше 18 лет и по Z-критерию до 18 лет. Т-критерий - это количество стандартных отклонений (SD) ниже среднего показателя, характерного для пика костной массы.

По данному показателю можно

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования активности ферментов мочи представлены в табл. 1.

В группе больных гемофилией выявлено увеличение активности практически всех исследуемых ферментов: активность НАГ превышала контрольные показатели в 2,5 раза, ЩФ и ЛАП – в 2 раза, ГГТ – более чем в 1,5 раза. Это позволило нам предположить, что при гемофилической нефропатии в патологический процесс вовлечён тубулярный отдел нефрона, причём выявлена активность как мембран-ассоциированных, так и внутриклеточных ферментов. Данный патологический процесс сопровождается повреждением щеточной каёмки, повышением проницаемости цитомембран, активацией лизосомальных систем клеток.

Однако необходимо отметить отсутствие у исследуемой группы больных изменений функциональной способности почек. Концентрация креатинина в сыворотке крови не отличалась от нормы (76±2 мкмоль/л; контроль – 75±2 мкмоль/л; p>0,5), скорость клубочковой фильтрации составляла 98±1 мл/мин (контроль – 99±1 мл/мин; p>0,5), относительная плотность мочи колебалась в пределах 1018 – 1023. Сходные данные при оценке функции почек у больных гемофилией были получены и другими исследователями.

Учитывая наличие у большинства больных гемофилией сонографических признаков нефролитиаза, мы провели исследование минерального обмена – Са, Р и мочевой кислоты, которые нередко участвуют в формировании уролитиаза (табл. 2).

В результате исследования установлено наличие у больных гемофилией синдрома гиперкальциурии. Для проведения сравнительного анализа характера энзимурии и кальциурии исследуемые больные были разделены на две группы. В первую группу включены

Таблица 1

определить риск развития переломов. Величина Т-критерия от –1.0 до –2.5 расценивается как остеопения (доклиническая стадия остеопороза), а показатель ниже –2.5 как остеопороз. Z-критерий – это стандартное отклонение от значений лиц того же возраста, то есть популяционной нормы.

Результаты обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента и корреляционного анализа компьютерной программы Statistica for Windows 6.0. Показатели представлены как М±SD. Коэффициенты корреляции и различия средних считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости p<0,05.

Активность энзимов мочи у больных гемофилией (x ± m)

Группа обследованных	Число обследованных	ЩФ	ГГТ	ЛАП	НАГ
Больные гемофилией	57	4,1±0,8	4,0±0,5	6,1±0,8	0,40±0,06
Контрольная	30	2,1±0,1	2,5±0,2	3,3±0,3	0,15±0,03
p		<0,02	<0,02	<0,01	<0,01

Таблица 2

Содержание (в ммоль/л) кальция, фосфора и мочевой кислоты в моче у больных гемофилией (x ± m)

Группа обследованных	Число обследованных	Са	Р	Мочевая кислота
Больные гемофилией	57	4,5±0,5	20,2±3,1	3,2±0,3
Контрольная	30	1,7±0,3	20,5±2,1	3,5±0,3
p		<0,001	>0,5	>0,5

больные с гиперкальциурией, во вторую – с нормо-кальциурией. У больных первой группы содержание ферментов в моче, связанных со щёточной каёмкой (ГГТ и ЩФ), значительно превышало контрольные показатели, тогда как во второй группе не отличалось от нормы. Активность цитозольного и лизосомального ферментов (ЛАП и НАГ) в первой и второй группах не различалась, но превышала контрольные значения.

Учитывая значимую разницу в активности мембран-ассоциированных энзимов (ГГТ и ЩФ) между первой и второй группами, мы провели корреляционный анализ взаимосвязи концентрации Са и активности ГГТ и ЩФ в моче. Установлена статистически значимая прямая связь между выраженностью кальциурии и активностью в моче как ГГТ (r = 0,61; р<0,05), так и ЩФ (r = 0,69; р<0,05).

Исходя из данных разных авторов о повреждающем действии гиперкальциурии на тубулярный отдел нефрона и опираясь на результаты нашего исследования, можно считать, что у больных гемофилией поражение проксимального отдела канальцев (в частности повреждение щёточной каёмки нефротелия) связано с высокой экскрецией кальция с мочой. Это позволяет высказать предположение, что гиперкальциурия, по-видимому, является одним из факторов, лежащих в основе гемофилической нефропатии.

Учитывая гиперкальциурию и наличие артропатий у больных гемофилией, нами проведено исследование минеральной плотности костной ткани с помощью компьютерной денситометрии. Было выявлено статистически значимое снижение минеральной плотности костной ткани в области поясничного отдела позвоночника и в проксимальном отделе бедренной кости, что является общепризнанным критерием системного остеопороза (Т = -1,44±0,17; Тк = +0,45±0,31; Р<0,05 и Z = -1,38±0,14; Zк = +1,47±0,33; Р<0,05).

Учитывая разную степень снижения минеральной плотности костной ткани у исследуемых больных, последние были разделены на две группы. В первую группу включены 12 больных без снижения МПКТ и начальными проявлениями остеопении (Т 1 = -0,83±0,09; Z 1 = -0,87±0,08), во вторую группу – 40 больных с выраженной остеопенией и остеопорозом (Т 2 = -2,31±0,17; Z 2 = -2,12±0,14), (Р т1-2 <0,05; Р z1-2 <0,05).

У этих двух групп больных проведено исследование основных маркёров метаболизма костной ткани (табл. 4, 5).

У больных без снижения МПКТ и начальными проявлениями остеопении определялось повышение активности костного изофермента щелочной фосфатазы, а также увеличение уровня оксипролина в сыворотке крови, что свидетельствует об ускоренном обмене костного коллагена на фоне умеренной активации остеолитических и остеобластических процессов, при сохранении нормальных показателей Са и Р в крови и моче.

У больных с выраженной остеопенией и остеопорозом наблюдалось умеренное повышение концентрации Са и Р в сыворотке крови и значительное увеличение экскреции кальция с мочой, а также высокая активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови, значительное увеличение концентрации оксипролина сыворотки крови и его повышенное выделение с мочой. Данные изменения свидетельствуют о выраженных остеолитических процессах, сопровождающихся резорбцией минеральной части костной ткани. При этом, учитывая данные денситометрии и биохимических исследований, можно предположить преобладание остеолизиса, несмотря на значительную активацию и остеопроли-феративных процессов (высокая активность костной фракции щелочной фосфатазы).

Таким образом, у большей части больных тяжёлой формой гемофилии имеет место общее снижение минеральной плотности костной ткани, что сопровождается гиперкальциурией, которая в свою очередь является одним из факторов повреждения канальцев почек по данным изучения активности тубулярных ферментов мочи. Исследование характера энзимурии позволило нам уточнить топику и степень повреждения нефрона у больных гемофилией. Результаты общепринятых лабораторных методов исследования почек (общий анализ мочи, определение клубочковой фильтрации, концентрации креатинина в сыворотке крови) у больных гемофилией были в пределах нормы. Между тем исследование активности энзимов мочи показало наличие у большинства больных различных по степени и характеру повреждений тубулярных структур нефрона. Основываясь на этом, можно счи-

Таблица 3

Активность ферментов мочи больных гемофилией (ед/ммоль креатинина) с нормо- (i группа) и гиперкальциурией (ii группа)

Группы больных	№	Са мочи, моль/л	Коэффициент Са/креатинин мочи	ЩФ	ГГТ	ЛАП	НАГ
I группа	18	1,6±0,2	0,27±0,02	2,2±0,9	2,0±0,4	5,6±1,1	0,28±0,04
II группа	39	5,1±0,2	0,58±0,02	6,7±1,0	4,6±0,7	6,4±0,9	0,42±0,08
Контроль (к)	30	1,7±0,2	0,25±0,02	2,1±0,1	2,5±0,2	3,3±0,3	0,15±0,03
p I-II		<0,001	<0,001	<0,01	<0,01	>0,5	<0,2
p II-к		<0,001	<0,001	<0,001	<0,01	<0,01	<0,01
p I-к		>0,5	>0,5	>0,5	>0,5	<0,05	<0,01

Таблица 4

Основные показатели минерального обмена

Группы больных	№	Концентрация в сыворотке ммоль/л		Концентрация в моче ммоль/л
		Са	Р	Са	Р
I группа	12	2,35±0,04	1,18±0,06	1,71±0,32	20,24±3,06
II группа	45	2,57±0,02	1,63±0,06	5,43±0,21	31,60±9,12
Контроль (k)	30	2,34±0,03	1,16±0,05	1,65±0,21	20,45±2,04
p		p I-k>0,5 p II-k<0,001 p I-II<0,001	p I-k>0,5 p II-k<0,001 p I-II<0,001	p I-k >0,5 p II-k<0,001 p I-II<0,01	p I-k >0,5 p II-k >0,5 p I-II>0,5

Таблица 5

Показатели метаболизма органического матрикса костной ткани у больных гемофилией

Группы больных № Сыворотка крови Моча № Оксипролин мкмоль/л Оксипролин мг/л Оксипролин/ креатинин I группа 12 132,4+9,1 24,4+0,8 27,4+2,1 2,0+0,4 II группа 45 285,3+29,1 29,8+0,67 54,3+2,5 4,1+0,4 Контроль (k) 30 37,0+2,9 19,5+1,8 28,1+1,8 2,3+0,2 p p I-k<0,001 p II-k<0,001 p I-II<0,001 p I-k<0,05 p II-k<0,001 p I-II<0,001 p I-k>0,5 p II-k<0,001 p I-II<0,001 p I-k>0,5 p II-k<0,001 p I-II<0,001 тать, что исследование активности ферментов мочи при гемофилической нефропатии перспективно для ранней диагностики и оценки динамики поражения различных отделов нефрона.

Представленный материал позволяет нам рекомендовать включить определение активности энзимов мочи в комплексный план исследования больных гемофилией. Метод неинвазивен, безвреден, высокоинформативен.