Ферментолиз сырья как фактор интенсификации процесса выделения фенольных веществ облепихового шрота

Введение . Одним из важных аспектов интенсификации технологии выделения целевых продуктов из различных биологических объектов, в том числе растительного сырья и продуктов его переработки, является использование высокоэффективных биотехнологических методов подготовки сырья [1–3]. Так, предобработка сырья ферментными препаратами, с одной стороны, может быть рассмотрена как способ интенсификации последующих стадий производства биологически активных веществ за счет повышения доступности сырья к дальнейшей переработке, с другой – применение ферментных препаратов позволяет освободить готовый продукт от части балластных веществ, существенно влияющих на выход целевого продукта, в том числе снижая его качественные характеристики и затрудняя очистку [4].

Некрахмалистые полисахариды, являясь компонентами растительных клеточных стенок, придают им прочность и обуславливают жесткость структуры. Применение ферментов, расщепляющих пектин, целлюлозу и гемицеллюлозу, неизбежно вызовет их деструкцию, приведет к необратимым нарушениям целостности клеточной стенки, ее дестабилизации и, как следствие, увеличению выхода экстрактивных веществ [5–7]. Кроме того, гидролиз полисахари- дов сопровождается высвобождением связанных с ними фенольных веществ. Поэтому определяющее значение имеет выбор ферментных препаратов, под действием которых растительная ткань размягчается, клеточная проницаемость возрастает, выход экстракта увеличивается, за счет этого извлечение фенольных веществ из шрота облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.) возможно реализовать с максимальной эффективностью.

Цель исследования: изучение процесса гидролиза балластных веществ обезжиренного облепихового шрота ферментными препаратами и их мультиэнзимными композициями для увеличения выхода суммы фенольных веществ.

Задача исследования: исследовать содержание фенольных веществ в ферментолизатах облепихового шрота, полученных обработкой «ЦеллоЛюкс А», Ultraflo, Ultraflo MAX, Brew Zyme BGX, Pectinex BE 3-L и их мультиэнзим-ными композициями; изучить влияние мульти-энзимных композиций на степень разрушения клеточной стенки облепихового шрота.

Объектами исследования являлись:

• 1.    Ферментные препараты и их мультиэн-зимные композиции (МЭК), характеристика которых приведена в таблице 1.

• 2.    Образцы обезжиренного облепихового шрота (рис. 1), полученные в результате реализации промышленной технологии выделения

  облепихового масла АО «Алтайвитамины» (2016–2018 гг.) [8], основные характеристики которых приведены в таблицах 2, 3.

Таблица 1

Ферментный препарат	Механизм действия	Оптимальные условия для действия
		Активная кислотность среды, ед. рН	Температура, °С
«ЦеллоЛюкс А» (ООО ПО «Сиббио-фарм», Россия)	Гидролиз целлюлозы, β-глюкана, ксилана, глюкоамилазы	3,5–6,0	45–60
Ultraflo XL (Novozymes A/S, Дания)	Гидролиз целлюлозы и гемицеллюлозы	4,0–6,0	30–60
Ultraflo MAX (Novozymes A/S, Дания)	Гидролиз гемицеллюлозы, ксилана, целлюлозы, арабиноксиланов	4,0–6,0	50–60
Brew Zyme BGX (Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A., Польша)	Гидролиз β-глюканов, ксиланов и целлюлозы	5,0–5,5	50–55
Pectinex BE 3-L (Novozymes A/S, Дания)	Гидролиз пектина	4,5–6,0	50–60

Свойства используемых ферментных препаратов

Рис. 1. Внешний вид обезжиренного облепихового шрота

Таблица 2

Показатель, %	2016 г.	2017 г.	2018 г.	Среднее значение
Массовая доля влаги	5,1±0,4	5,2±0,4	5,0±0,4	5,1±0,4
Массовая доля золы	2,8±0,2	2,9±0,2	3,0±0,2	2,9±0,2
Металлопримеси и посторонние вещества	Не обнаружено
Массовая доля органических кислот в пересчете на яблочную	3,1±0,4	3,2±0,4	3,3±0,4	3,2±0,4
Массовая доля сахаров	4,6±0,1	4,7±0,1	4,5±0,1	4,6±0,1
Массовая доля экстрактивных веществ	18,8±0,5	19,2±0,5	19,0±0,5	19,5±0,5
Массовая доля пектиновых веществ (протопектин)	1,39±0,04	1,30±0,04	1,36±0,04	1,35±0,04
Массовая доля суммы полифенолов	0,54±0,1	0,50±0,1	0,52±0,1	0,52±0,1

Таблица 3

Показатели микробиологической безопасности образцов облепихового шрота (n = 3)

Образец	КМАФАнМ, КОЕ/1 г	Дрожжи, КОЕ/г	Плесневые грибы, КОЕ/г	БГКП не допускаются в массе продукта, г
Норма по ТР ТС 021/2011 мг/кг, не более	5,0·104	200	500	0,1
2016 г.	< 15	< 15	Не обнаружено	Не обнаружено
2017 г.	< 15	< 15
2018 г.	< 15	< 15

Физико-химические показатели образцов облепихового шрота (n = 3)

Методы исследования. Физико-химические показатели определяли стандартными методами: массовая доля влаги – по ГОСТ 13979.1-68, массовая доля золы – по ГОСТ 13979.6-69, наличие металлических примесей и посторонних веществ – по ГОСТ 11246-96, содержание экстрактивных веществ – по ГОСТ 13979.2-94, редуцирующих сахаров – перманганатным методом по ГОСТ 8756.13-87, полифенольных соединений – по ГОСТ Р 55488-2013, пектиновых веществ – кальций-пектатным методом по [9], показатели микробиологической безопасности – по ГОСТ 10444.15-94, ГОСТ 31747-2012 и ГОСТ 10444.122013.

Для проведения ферментативного гидролиза облепихового шрота навеску предварительно измельченного шрота помещали в емкость и приливали дистиллированную воду до достижения гидромодуля 1 : 20. Смесь нагревали до температуры 40 °С и при перемешивании добавляли ферментный препарат или МЭК в количестве 0,05 % к массе обрабатываемого шрота. Полу- ченный субстрат термостатировали при температуре 55 °С в течение 1,5 ч. Образующийся гидролизат отфильтровывали под вакуумом и использовали для дальнейшего определения суммы фенольных веществ.

Для оценки эффективности обработки облепихового шрота ферментными препаратами и МЭК в гидролизатах определяли сумму фенольных веществ колориметрическим методом с использованием сканирующего спектрофотометра Shimadzu UV 1800 ( Shimadzu , Япония) и реактива Фолина-Чокальтеу [10].

Результаты исследования и их обсуждение. С учетом данных о составе полисахаридов облепихового шрота для проведения ферменто-лиза были выбраны коммерческие ферментные препараты, обладающие пектолитической, целлюлазной, бета-глюканазной, ксиланазной, глюкоамилазной активностями. Дозировка ферментных препаратов составляла 0,05 % к массе обрабатываемого облепихового шрота. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.

140,00

(Я ^ 130,00

• 5 2 120,00

• & -

• й о 110,00

• § 1 100,00

й 90,00

• р л

а о 80,00

• *5 и

• 70,00

60,00

ЦеллоЛюкс Ultraflo

А     МАХ

BrewZyme BGX

Pectinex BE Ultraflo XL 3-L

Рис. 2. Содержание суммы фенольных веществ в ферментолизатах облепихового шрота в зависимости от используемого ферментного препарата

Так, усредненное значение массовой концентрации суммы фенольных веществ при использовании ферментных препаратов целлюлолитического и глюканолитического действия Ultraflo XL (штамм продуцент – Humicola insolens) и Brew Zyme BGX (штамм продуцент – Trichoderma longibrachiatum) в условиях эксперимента оказалось максимальным, так как указанные ферментные препараты характеризуются наличием в их составе активных компонентов целлюлолити- ческой системы (комплекса эндо- и экзоферментов) и содержат β-глюканазу и набор пентозаназ, в том числе ксиланазу и арабаназу, гидролизующих слизистые вещества шрота.

Для интенсификации ферментолиза и увеличения выхода фенольных веществ на следующем этапе исследования проводили ферментативный гидролиз облепихового шрота с применением МЭК. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3.

170,00

X

160,00 п

150,00

140,00

130,00

и 8

120,00 м «

110,00 о

100,00

90,00

ЦеллоЛюкс А + BrewZyme BGX + Ultraflo XL + BrewZyme BGX + Ultraflo MAX + Pectinex BE 3-L Ultraflo XL Pectinex BE 3-L Pectinex BE 3-L ЦеллоЛюкс А

Рис. 3. Содержание суммы фенольных веществ в ферментолизатах облепихового шрота в зависимости от используемой МЭК

На данном этапе исследования наиболее удачными МЭК были BrewZymeBGX–UltrafloXL (1:1) и Brew Zyme BGX – Pectinex BE 3-L (1:1). В результате более эффективного ферментативного гидролиза полисахаридов облепихового шрота происходит интенсификация экстракции комплекса полифенолов за счет разрушения клеточной стенки частичек шрота и увеличения движущей силы диффузионных процессов.

Для подтверждения гипотезы о глубоком разрушении клеточной стенки облепихового шрота дополнительно проводили прямое микроскопирование размоченных в капле глицерина частичек шрота до и после обработки МЭК Brew Zyme BGX – Ultraflo XL (1:1) (рис. 4).

а                                         б

Рис. 4. Микроскопический анализ облепихового шрота ( х 600 крат): а – до гидролиза; б – после гидролиза

Из рисунка 4 видно, что пористость клеточной стенки после обработки ферментными препаратами существенно увеличивается.

Заключение. Установлено, что максимальная концентрация суммы фенольных веществ в ферментолизатах облепихового шрота при использовании ферментных препаратов Ultraflo XL и Brew Zyme BGX – 123,0 и 128,0 мг/дм3 соответственно, за счет наличия в их составе активных компонентов целлюлолитической системы, а также содержания β-глюканазы и пентозаназ, гидролизующих слизистые вещества шрота. За счет более полной и глубокой конверсии полисахаридов облепихового шрота ферментными препаратами в составе мультиэнзимных композиций наблюдается синергетический эффект, который проявляется во взаимном усилении их действия, выражающийся в интенсификации процесса разрушения клеточной стенки и облегчении последующей экстракции комплекса фенольных веществ из разрушенных клеток. Так, содержание суммы фенольных веществ в ферментолизате облепихового шрота, обработанного мультиэнзимной композицией Brew Zyme BGX – Ultraflo XL (1:1) составило 153,0 мг/дм3, что превышает содержание суммы фенольных веществ в ферментолизатах ферментных препаратов в 1,2–2,0 раза. При микроскопировании частичек шрота до и после обработки мультиэнзимной композицией Brew Zyme BGX – Ultraflo XL установлено, что пористость клеточной стенки после обработки ферментными препаратами существенно увеличивается, что способствует интенсификации диффузионных процессов. Таким образом, экспериментально доказано, что ферментативный гидролиз можно рассматривать как эффективный способ подготовки облепихового шрота к выделению фенольных веществ.