Физиологические характеристики тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Кеуwords: calves, phase of milk and vegetable nutrition, Kholmogory breed, platelets, aggregation, secretion

Интенсивность микроциркуляции играет существенную роль в сохранении общей жизнеспособности животного [2]. Весьма значимой для микроциркуляции крови считается состояние гемостатической активности тромбоцитов. Ее большое влияние на микроциркуляцию во многом определяет динамику анаболических процессов, а, следовательно, формирование продуктивных качеств сельскохозяйственных животных [8]. Известно, что тромбоцитарная активность способна меняться в ответ на многие влияния извне в течение жизни организма в условиях развития дисфункций и наступления патологии, а также в случае проведения лечебных воздействий [7]. Вместе с тем, несмотря на серьезную биологическую значимость функциональных свойств тромбоцитов, многие моменты их функционирования у молодняка крупного рогатого скота до сих пор изучены слабо. Существуют только единичные исследования, посвященные активности тромбоцитов у телят и коров разных пород при некоторых физиологических состояниях [4]. По этой причине имеющаяся информация не позволяет составить ясного понимания особенностей возрастной активности тромбоцитов у крупного рогатого скота разной породной принадлежности. Актуальность этих работ связана с большой биологической ролью гематологических показателей в регуляции кровотока в капиллярах, что весьма значимо для процесса роста телят и закладывания основ их мясной и молочной продуктивности [9]. Ввиду имеющихся межпородных различий в физиологических параметрах крупного рогатого скота и в уровне выраженности его продуктивных качеств [10], представлялось важным выяснить особенности активности тромбоцитов у телят высокоудойных пород, в том числе холмогорской породы на этапе становления продуктивности, то есть на протяжении раннего онтогенеза.

Целью работы была оценка возрастной динамики активности тромбоцитов у телят холмогорской породы на протяжении фазы молочнорастительного питания.

Материал и методы исследований.

Исследования проводились в строгом соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в научных целях (принята в Страсбурге 18 марта 1986 г. и подтверждена в Страсбурге 15 июня 2006 г.).

В исследовании было взято 46 телят чистопородных по холмогорской породе, которых получили после второй и третьей стельности от полностью здоровых коров. Все наблюдавшиеся телята подверглись обследованию пятикратно: на 31, 45, 60, 75

и на 90 сутки жизни.

У животных оценивали уровень выработки в их кровяных пластинках тромбоксана с учетом функциональных свойств циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы тромбоцитов по результатам проведения трех проб переноса с применением фотоэлектроколориметра [3]. У всех взятых в исследовании телят регистрировали концентрацию тромбоцитарного аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата и выявляли степень их секреции из тромбоцитов в ответ на воздействие на тромбоциты коллагена. В тромбоцитах оценивали количество актина и миозина в условиях вне активации и в случае влияния на тромбоциты аденозиндифосфата [3].

У животных определяли время появления признаков агрегации тромбоцитов (АТ), используя визуальный микрометод [12]. В ходе данного исследования был применен ряд стандартных индукторов, вызывающих тромбоцитарную агрегацию: аденозиндифосфат (в дозе 0,5 х 10-4 М), коллаген (при разведении 1:2 основной суспензии), тромбин (в дозе 0,125 ед/мл), адреналин (в дозе 5,0x10-6 М) и ристомицин (в дозе 0,8 мг/мл). АТ у телят выясняли в плазме, богатой тромбоцитами, после ее стандартизации по уровню тромбоцитов до значения 200x109 тромбоцитов на литр. Состояние внутрисосудистой активности тромбоцитов оценивали, применяя фазовоконтрастную микроскопию [12]. Статистическая обработка полученной в исследовании цифровой информации производилась с помощью пакета программ «Статистика для Windows v. 6.0», «Microsoft Excel». Различия в данных считались достоверными в случае Р<0,05.

Результат исследований.

Количество тромбоцитов, имеющих дискоидную форму, в крови наблюдавшихся животных к 45-суточному возрасту понижалось на 16,0 %, в последующем постепенно повышаясь до конца наблюдения до уровня 69,1±0,22 %. В этих условиях содержание в крови животных активных тромбоцитов к 45 суткам возрастало на 47,8 %, в последующем постепенно возвращаясь к начальным значениям. Число свободно циркулирующих по их крови мелких, а также средних и крупных тромбоцитарных агрегатов к этому возрасту повышалось на 39,2 и на 65,0 %, соответственно, в последующем уменьшаясь и достигая к концу наблюдения исходных величин (Таблица 1).

Таблица 1 – Внутрисосудистая активность тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Учитываемые в работе показатели	Возраст телят холмогорской породы, n=46, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Уровень тромбоцитов-дискоцитов, %	68,0±0,15	58,6±0,36 Р<0,01	61,0±0,19 Р<0,05	63,2±0,17 Р<0,05	69,1±0,22 Р<0,05
Сумма активированных форм тромбоцитов, %	28,0±0,10	41,4±0,27 Р<0,01	37,0±0,16 Р<0,01	34,8±0,21 Р<0,05	30,9±0,24
Количество малых тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	5,1±0,14	7,1±0,19 Р<0,01	6,8±0,09 Р<0,01	6,0±0,11 Р<0,05	5,4±0,10
Количество средних и больших тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	0,20±0,011	0,33±0,024 Р<0,01	0,30±0,014 Р<0,01	0,27±0,010 Р<0,01	0,21±0,012

Примечание: Р – достоверность динамики показателей по отношению к 31 суточному возрасту. В последующих таблицах обозначения сходные

У молодняка холмогорской породы в возрасте 45 суток выявлено краткое усиление физиологических свойств тромбоцитов. В это время у телят АТ в ответ на коллаген наступала раньше на

44,5 %, в последующем тормозясь и к концу наблюдения, значительно не отличаясь от исходных данных. Сходное кратковременное ускорение процесса АТ в эти сроки было найдено в отношении всех остальных индукторов: аденозиндифосфата – на 33,2 %, ристомицина на 27,4 %, тромбина на 26,9 % и адреналина на 19,7 %. Во всех случаях агрегационный ответ тромбоцитов со всеми индукторами достигал исходного уровня к 90 суткам жизни.

Таблица 2 – Агрегационная функция тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Показатель			Возраст телят холмогорской породы, n=46, M±m
			31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Время развития AТ с АДФ, с			31,3±0,12	23,5±0,29 Р<0,01	26,2±0,31 Р<0,01	28,3±0,25 Р<0,05	32,0±0,34
Время   развития коллагеном, с	AТ	с	27,6±0,19	19,1±0,23 Р<0,01	23,6±0,17 Р<0,01	24,0±0,19 Р<0,05	27,8±0,15
Время   развития тромбином, с	AТ	с	43,4±0,17	34,2±0,22 Р<0,01	37,5±0,12 Р<0,05	39,2±0,16 Р<0,05	42,9±0,07
Время   развития ристомицином, с	AТ	с	41,8±0,12	32,8±0,29 Р<0,01	36,7±0,18 Р<0,05	38,4±0,15 Р<0,05	41,5±0,19
Время   развития адреналином, с	AТ	с	85,8±0,17	71,7±0,28 Р<0,01	26,2±0,23 Р<0,05	79,1±0,19 Р<0,05	86,0±0,25 Р<0,05

Таблица 3 – Внутритромбоцитарные показатели у телят холмогорской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Показатель	Возраст телят холмогорской породы, n=46, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Количество АТФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109 тр.	5,89±0,019	6,78±0,020 Р<0,01	6,52±0,019 Р<0,05	6,01±0,012 Р<0,05	5,92±0,019
Количество АДФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109тр.	3,81±0,009	4,47±0,012 Р<0,01	4,28±0,008 Р<0,05	4,14±0,012 Р<0,05	3,80±0,014
Выраженность секреции АТФ,%	42,2±0,13	52,6±0,26 Р<0,01	47,5±0,11 Р<0,05	46,6±0,15 Р<0,05	43,0±0,11
Выраженность секреции АДФ,%	50,1±0,06	62,8±0,14 Р<0,01	56,2±0,17 Р<0,05	54,4±0,12 Р<0,05	50,7±0,17
Уровень   восстановления   АТ   при проведении КАП, %	82,4±0,07	97,8±0,10 Р<0,01	94,5±0,08 Р<0,05	92,0±0,10 Р<0,05	87,8±0,12
Уровень   восстановления   АТ   при проведении КИП, %	50,1±0,10	63,0±0,16 Р<0,01	57,2±0,11 Р<0,05	53,2±0,09	49,9±0,19
Уровень АТ в простой пробе переноса, %	39,4±0,03	50,1±0,27 Р<0,01	44,6±0,18 Р<0,05	41,8±0,14 Р<0,05	38,5±0,10
Количество актина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	38,9±0,07	52,3±0,18 Р<0,01	43,5±0,09 Р<0,05	42,2±0,17 Р<0,05	39,1±0,19
Количество актина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	48,5±0,12	59,8±0,12 Р<0,01	55,2±0,16 Р<0,05	51,8±0,05 Р<0,05	49,1±0,08
Количество миозина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	20,0±0,19	29,6±0,21 Р<0,01	26,0±0,16 Р<0,05	21,7±0,12 Р<0,05	19,8±0,09
Количество миозина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	38,2±0,14	48,5±0,20 Р<0,01	43,7±0,19 Р<0,05	41,5±0,22 Р<0,05	39,0±0,25
Одним из важных механизмов сомнения лежало кратковременное ускорения развития АТ у телят в возрасте усиление в тромбоцитах телят 45 суток можно считать кратковременное циклооксигеназы (на 18,7 %) и усиление тромбоксаногенерации в их тромбоксансинтетазы (на 25,7 %). Об этом тромбоцитах. На это указывал рост на говорило выявленное у них в возрасте 45 27,1% АТ, регистирируемой в простой суток усиление АТ в условиях коллаген-пробе переноса. В основе этого без аспириновой пробы до 97,8±0,10 % и рост

АТ в условиях коллаген-имидазольной пробы до 63,0±0,16 %, что сменялось понижением этих показателей до исходных величин к 90-суточному возрасту (Таблица 2).

Исходно невысокое содержание в тромбоцитах обследованных животных аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата возрастало к 45 суткам жизни на 15,1 и 17,3 %, на фоне активации их секреции из гранул тромбоцитов на 24,6 и 25,3 %. Найденные изменения этих показателей быстро сменялись их возвращением к 90-суточному возрасту к значениям исхода.

Содержание актина и миозина в дискоидных тромбоцитах обследованных животных к возрасту 45 суток быстро повышалось на 34,4 и 48,0 %, затем постепенно понижаясь и достигая к 90 суткам уровня близкого к исходу (39,1± 0,19 % и 19,8±0,09 % общего белка в тромбоците). Кроме того, у обследованного молодняка к 45 суткам в агрегирующих тромбоцитах найдена кратковременная активация дополнительной генерации актина на 23,3% и миозина на 26,9 %, которая полностью устранялась у них к 90-суточному возрасту (Таблица 3).

Из существующего уровня научных знаний известна серьезная значимость поддержания функционального оптимума системы крови. Очень часто параметры крови играют роль маркеров для отслеживания текущих функциональных состояний [14]. Не вызывает сомнений их большая значимость в обеспечении нормального функционирования организма животных, в том числе продуктивных. Особый интерес у биологов вызывает в числе прочих гематологических изменений возрастная динамика тромбоцитарной активности у высокопродуктивных по объему удоя пород крупного рогатого скота. Среди этих пород пристальное внимание современных исследователей привлекают российские породы. Изучение различных аспектов их физиологии способно помочь лучше понять основы их высокой продуктивности в зрелом возрасте и сформировать более четкую картину требующихся условий для сохранения и повышения экспрессии у них хозяйственно важных параметров. Последовательное изучение активности тромбоцитов у молодняка крупного рогатого скота высокомолочных пород должно прояснить ее динамику в течение раннего онтогенеза и проследить ее изменения по мере увеличения возраста, а значит в ходе реализации породного потенциала молочной продуктивности [11]. Потребность в решении этой проблемы послужила базисом для проведения настоящего исследования на телятах холмогорской породы.

В ходе оценки результатов АТ, полученных в случае применения коллагена и ристомицина у телят холмогорской породы к возрасту 45 суток было установлено кратковременное усиление адгезии кровяных пластинок, устранявшееся к концу рассматриваемой фазы. Видимо, это происходило через реализацию двух механизмов [1]. Один из них заключается в пиковом ускорении у телят на этом этапе тромбоцитарной агрегации под действием коллагена. Можно думать, что данные изменения связаны с кратковременным нарастанием у телят в этом возрасте на тромбоцитах плотности гликопротеидов типа Iа–IIа и типа VI, выполняющих функций рецепторов к коллагену. Вторым путем активизации тромбоцитарной адгезии у обследованных животных в возрасте 45 суток, следует считать увеличение на их поверхности количества гликопротеидов типа Ib, обеспечивающих рецепцию фактора Виллебранда. Реализации данного механизма способствует, видимо, имеющий место в это время эпизод роста концентрации данного фактора в их крови. Наличие изменений, обеспечивающих второй механизм усиления адгезии, в полной мере подтверждались кратковременным ускорением у телят в возрасте 45 суток динамикой АТ под действием ристомицина.

Найденное у наблюдавшегося молодняка в возрасте 45 суток онтогенеза ускорение развития агрегации тромбоцитов во многом обеспечивает им требующуюся на этом этапе жизни высокую степень протекции от кровопотери. Очевидно, она реализуется у животных за счет выраженного, но кратковременного напряжения многих регуляторных систем. В возрасте 45 суток у телят холмогорской породы происходит кратковременное ускорение АТ в ответ на сильные индукторы (коллаген и тромбин), что без сомнения связано с ростом количества рецепторов к ним на тромбоцитах животных в этом возрасте. Данные изменения всегда сопровождаются нарастанием функциональных возможностей фосфолипазы С, компонентов фосфоинозитольного пути и усилением фосфолирирования протеинов, образующих тромбоцитарную сократительную систему. Кратковременно возникающая в этих условиях в тромбоцитах телят активация синтеза молекул инозитолтрифосфата напрямую сопряжена с непродолжительным ростом выхода Са2+ из тромбоцитарных плотных гранул. Данный процесс является важным стимулом к самосборке и сокращению комплекса актомиозина. По этой причине его изменения весьма значимы для развития у телят в возрасте 45 суток пиковой активации секреторного процесса и последующего его плавного ослабления [5].

Найденная у обследованных телят сходная динамика АТ в отношении слабых индукторов (аденозиндифосфат и адреналин) помогла раскрыть изменения ряда реализующих ее механизмов в течение фазы молочно-растительного питания. Имевшее место пиковое ускорение развития АТ при действии на тромбоциты слабых индукторов следует связывать с быстропроходящим нарастанием у телят холмогорской породы в 45-суточном возрасте плотности рецепторов к ним на мембранах тромбоцитов, а также с повышением числа на них рецепторов к фибриногену (GPIIb-IIIа) и ростом активности в кровяных пластинках фосфолипазы А2. Наступающая при этом короткая интенсификация освобождения из тромбоцитарных фосфолипидов молекул арахидоновой кислоты, обеспечивала кратковременное нарастание синтеза тромбоксана А2 за счет большей поставки сырья для этого процесса [6]. Непосредственное увеличение синтеза тромбоксана у телят в 45 суточном возрасте, найденное в ходе проб переноса обеспечивалось кратковременной активацией в эти сроки циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы, постепенно в последующем нивелировавшейся до уровня исхода. Важным для развития пикового ускорения АТ у молодняка холмогорской породы в отношении слабых индукторов также, видимо, является повышение в их тромбоцитах базального и активированного уровня актина и миозина при усилении выброса аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата из состава гранул тромбоцитов в условиях реализации секреторного процесса [12].

Изменения тромбоцитов на ранних этапах их активизации у телят холмогорской породы были установлены в ходе оценки их внутрисосудистой активности при использовании фазовоконтрастной микроскопии. Найденное у животных пиковое повышение количества активированных тромбоцитов в 45-суточном возрасте указывало на кратковременное увеличение у них степени чувствительности тромбоцитов к присутствующим в крови индукторам тромбоцитарной агрегации. Кроме того, это говорило о нарастании у них к 45 суткам степени доступности для крови субэндотелия сосудов, вызывающего активацию кровяных пластинок. Это несомненно являлось значимой причиной кратковременного увеличения в крови животных в этом возрасте уровня свободно циркулирующих тромбоцтарных агрегатов. Также выявленные изменения говорили о непродолжительном нарастании в крови животных в возрасте 45 суток концентраций индукторов агрегации тромбоцитов в плазме, способных к растворению.

Выявленное у телят в начале третьей фазы раннего онтогенеза короткое усиление агрегации тромбоцитов вызывало в их крови короткое нарастание количества их активных разновидностей и их агрегатов. Найденные изменения, видимо, были вызваны у животных изменениями в составе корма и перестройкой в обмене веществ, одновременно обеспечивая минимизацию риска кровотечений и опасности закупорки тромбоцитарными агрегатами большого количества микрососудов в тканях. Быстрая обратная динамика выраженности внутрисосудистой агрегации тромбоцитов у молодняка холмогорской породы показала сохранение в его первичном гемостазе функционального баланса между явлениями протромботической и антитромботической направленности за счет наличия выраженного потенциала к наращиванию функциональной активности у стенок сосудов. Несомненно, что сбалансированное функционирование тромбоцитов и стенок сосудов обеспечивает телятам холмогорской породы в течение второй половины фазы молочно-растительного питания быстрое обратное развитие наступающих в ее начале изменений в первичном гемостазе. Видимо, данная оптимизация развивалась по мере адаптации животных к потреблению растительных кормов, что устраняло условия, приведшие к росту функциональной напряженности между протромботическими и антитромботическими процессами в первичном гемостазе.

Заключение. У телят холмогорской породы к 45 суткам жизни наступает непродолжительное повышение активности тромбоцитов. Ее развитие можно рассматривать как адаптивную реакцию их организма на начало поедания кормов растительного состава. Выявленное усиление тромбоцитарной активности имеет в своей основе кратковременную интенсификацию механизмов, обеспечивающих тромбоцитарную адгезию, агрегацию и секрецию. Возврат активности тромбоцитов к уровню исхода происходит у телят холмогорской породы между 45 и 90 сутками жизни, обеспечивая сохранение оптимума кровотока в органах, а значит процессов в них обмена веществ и адаптации животного к существующим условиям среды и потребляемым кормам.

Резюме

В работе была оценена возрастная динамика активности тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы молочно-растительного питания. Установлено, что у молодняка этой породы в возрасте 45 суток происходит ускорение процесса агрегации тромбоцитов, которое устраняется к 90 суткам жизни. Количество неактивных тромбоцитов в крови телят в 45 суток понижалось на 16,0 % и возвращалось к исходу к 90 суткам. При этом у них в 45-суточном возрасте имел место быстро устранимый рост количества активных тромбоцитов на 47,8 % и увеличение содержания присутствующих в крови мелких, а также средних и больших их агрегатов на 39,2 и 65,0 %, соответственно. У наблюдавшихся телят к 45 суткам жизни отмечена интенсификация на 27,1 % синтеза в тромбоцитах тромбоксана в результате роста активности в них циклооксигеназы на 18,7 % и тромбоксансинтетазы на 25,7 %. У животных на 45-е сутки жизни выявлено кратковременное увеличение в тромбоцитах количества актина и миозина на 34,4 и 48,0 %. Это сопровождалось у них в эти сроки наблюдения в условиях агрегации тромбоцитов усилением дополнительного синтеза актина и миозина на 23,3 и 26,9 %, соответственно, устранявшееся к концу наблюдения.