Физиологические особенности антиоксидантной системы котов разных пород в связи с криорезистентностью спермы

Антиоксидантная система крайне важна для организма животных, так как она нейтрализует негативное влияние окислительного стресса. Окислительный стресс – это дисбаланс между выработкой и нейтрализацией активных форм кислорода (АФК). Неконтролируемое перепроизводство АФК приводит к перекисному окислению белков и липидов и повреждает нити ДНК, травмируя клетки и приводя к их гибели. Более важно это для репродуктивной системы, особенно если сперма будет использоваться в процессе искусственного осеменения после замораживания-оттаивания [1, 4, 6].

Живые организмы разработали ряд механизмов, направленных на детоксикацию активных форм кислорода (АФК). Окислительный стресс также может быть определен на основе концентрации побочных продуктов перекисного окисления. Малоновый диальдегид (МДА) является хорошо известным маркером перекисного окисления липидов в сыворотке крови и сперме. Доказано, что свободные радикалы кислорода играют определенную роль в патогенезе некоторых заболеваний и снижении криорезистентности спермы. Было доказано, что добавки с антиоксидантными веществами могут оказывать положительное влияние на криорезистентность спермы и на течение тех заболеваний, где чрезмерный окислительный стресс связан с его патогенностью [2, 5].

После    эякуляции     спермии подвергаются оксидативному стрессу, сопровождающемуся резким увеличением содержания активных форм кислорода

(АФК) в сперме. Еще больше генерируются активные формы кислорода при подготовке к криоконсервированию (разбавлении, эквилибрации), замораживании и размораживании эякулятов. Это обусловлено активированием свободнорадикальных процессов окислением липидных и белковых компонентов плазмы спермы и разбавителей, а также перекисным окислением ненасыщенных жирных кислот мембран половых клеток. Указанные изменения приводят к снижению активности, выживаемости и оплодотворяющей способности половых клеток. Тем не менее, рост окислительных процессов и генерация АФК является необходимым условием для проявления акросомной реакции и гиперактивного движения спермиев, оплодотворения яйцеклетки [5].

Защиту половых клеток самцов от разрушительного действия активных форм кислорода, а также поддержание окислительного баланса и регулирование процессов окисления обеспечивает многокомпонентная антиоксидантная система. Ферменты глутатионового цикла, каталаза (КАТ) и супероксиддисмутаза (СОД) создают энзиматическую, а витамины А, Е и С - неэнзиматическую антиоксидантную защиту. Так, СОД защищает половые клетки от избытка супероксиданионов (O2-) и контролирует их капацитацию. Глутатионпероксидаза (ГПО) и каталаза разрушают перекись водорода и проявляют положительную зависимость с количеством морфологически нормальных спермиев в эякулятах, также участвуя в регуляции процесса их капацитации Тем не менее, на физиологические характеристики спермиев (подвижность, выживаемость, капацитацию) активность антиоксидантных ферментов влияет неоднозначно. Например, в сперме мышей СОД или каталаза обеспечивают капацитацию половых клеток, но вместе они уменьшают этот процесс даже до более низких значений, чем наблюдается в контроле. В сперме хомяков каталаза уменьшает количество спермиев с акросомной реакцией при их капацитации [6-10].

У кошек исследователи изучали лишь влияние антиоксидантной системы организма при сердечно-сосудистой патологии [11]. На сегодняшний день, в доступной литературе нам не удалось найти исследований антиоксидантной системы кошек разных пород в связи с криорезистентностью их спермы.

В связи с этим целью наших исследований было изучение физиологических особенностей антиоксидантной системы спермы котов разных пород в связи с криорезистентностью их эякулятов.

Материал и методы исследований.

Исследование выполняли с 2017 по 2022 гг. в Центре ветеринарной инновационный медицины РУДН (г. Москва), в ветеринарной клинике ООО «Биоконтроль» (г. Москва), в ветеринарной клинике при РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (г. Москва). В работе было использовано 145 половозрелых котов в возрасте от 2 до 8 лет, которые принадлежали к 8 различным породам (Бенгальская порода – 18 голов, Британская короткошерстная – 17 голов, Европейская – 19 голов, Сибирская порода – 19 голов, Персидская – 19 голов, Русская голубая – 18 голов, Мейн-кун – 17 голов, Сфинкс – 18

голов). Образцы спермы были собраны у каждого самца с использованием стандартизированной процедуры электроэякуляции и на искусственную вагину для кроликов. Электроэякуляцию осуществляли с помощью Electro Ejaculator e320 (Minitube, Tiefenbach, Germany) после введения ректального зонда диаметром 0,95 см [2]. Оценку, разбавление, охлаждение и криоконсервирование спермы котов выполняли по модифицированной нами Харьковской технологии [5] с применением разработанного нами экспериментального разбавителя. В размороженной сперме котов общепринятыми методиками [2] определяли подвижность и переживаемость спермиев при температуре 38°С в суховоздушном термостате. Активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО) и супероксиддисмутазы (СОД) – методом ИФА(ELISA); содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) - методом солевого гемолиза по T. Osakawa et al. [7-10].

Математико-статистические расчеты результатов ветеринарнофизиологических исследований осуществляли по общепринятым формулам критерия Стьюдента в компьютерной программе SPSS for Windows (IBM, USA).

Результат исследований.

Полученные данные исследований функционального состояния антикосидантной системы в сперме котов разных пород представлены в таблице 1.

Очень важным антиоксидантным ферментом является СОД, которая защищает половые клетки от негативного действия свободных радикалов, путем переработки опасных веществ в соединения, у которых токсичность значительно меньше. Активность супероксиддисмутазы (СОД) у восьми обследованных пород была примерно на сопоставимом уровне. Большей активностью данного фермента обладали коты Персидской породы (более 14,5 ∆U/мин/мл). На этом фоне уровень каталазы в их сперме был не самым большим (35,43 мМ/мин/мл), а активность глутатионпероксидазы (ГПО) была наименьшей (3,21 мМ/мин/мл) среди обследованных пород. При таком функциональном состоянии антиоксидантной системы в сперме наблюдалась наихудшая криорезистентность эякулятов – подвижность спермиев после оттаивания всего 22%, а переживаемость их в термостате не более 2,22 часов. Возможно,

это связано с тем, что в сперме котов Персидской породы наибольшее количество конечных продуктов перекисного окисления липидов   - диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), которые и оказали негативное действие на криорезистентность половых клеток котов данной породы.

Таблица 1 - Показатели антиоксидантной системы и криорезистентность спермы котов разных пород (M±m; n=1578)

Порода котов (количество голов)	Коли чество проб	Показатели антиоксидантной системы в сперме					Физиологические характеристики оттаянной спермы
		СОД, ∆U/мин/ мл	каталаза, мМ/ мин/мл	ГПО, мМ/ мин/мл	ДК, мкМ/л	МДА, нМ/мл	подвижность спермиев, %	пережива-емость при 38°С, часов
Бенгальская (18 котов)	189	12,68± 0,07	36,56± 0,19	4,01± 0,02	11,96± 0,08	3,86± 0,02	37,62± 1,09	4,23± 0,13
Британская (17 котов)	149	12,01± 0,18	28,01± 0,25**	3,84± 0,01	13,77± 0,13*	5,30± 0,04**	34,21± 0,67	3,88± 0,08*
Европейская (19 голов)	210	12,62± 0,08	25,02± 0,44**	3,73± 0,02	14,21± 0,08**	5,51± 0,04**	36,09± 1,68	2,42± 0,10***
Мейн-Кун (17 голов)	219	12,58± 0,16	26,51± 0,35**	3,65± 0,03	12,48± 0,15	4,74± 0,08*	33,70± 0,77*	3,35± 0,07**
Персидская (19 голов)	147	14,95± 0,14**	35,43± 0,24	3,21± 0,03*	15,46± 0,09***	6,01± 0,03***	22,0± 1,07***	2,22±0,10* **
Русская голубая    (18 голов)	255	13,75± 0,08*	29,36± 0,33**	3,95± 0,01	10,86± 0,06	4,15± 0,03**	32,73± 0,64**	3,48± 0,08**
Сибирская (19 голов)	208	11,39± 0,06	24,12± 0,17***	3,62± 0,02	15,11± 0,10**	4,25± 0,03**	32,78± 0,52**	3,41± 0,05**
Сфинкс (18 голов)	201	12,27± 0,13	29,96± 0,30*	3,75± 0,01	13,07± 0,10*	5,49± 0,04**	29,27± 0,48***	2,5± 0,07***

Примечание. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 в сравнении с Бенгальской породой.

Минимальные требования к деконсервированной сперме других видов животных (например, лошади) прописаны на уровне не менее 25 % подвижности спермиев после оттаивания и не менее 2,5 часов переживаемости в суховоздушном термостате при температуре тела каждого вида животного. Подобный уровень проходят все обследованные породы котов (кроме Персидской), начиная с самцов породы Сфинкс - более 29 % подвижности и 2,5 часа переживаемости спермиев. Однако количество повреждающих биологические мембраны агентов диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) у котов породы Сфинкс было на среднем уровне в сравнении с другими породами -13,07 мкМ/л и 5,49 нМ/мл соответственно. В то же время активность СОД, ГПО и каталазы была на сопоставимом, с другими породами, уровне.

Лучшая физиологическая активность антиоксидантной системы установлена нами у котов Бенгальской породы. На этом фоне у них наблюдалась лучшая криорезистентность спермы. Подвижность спермиев после оттаивания у котов Бенгальской породы была более 37 %, что на 3,41 % выше, чем у Британской породы, на 1,53 % - чем у Европейской породы, на 3,92 % (Р<0,05) - чем у породы Мейн-кун, на 15,62 % (Р<0,001) - чем у Персидской породы, на 4,89 % (Р<0,01) - чем у Русской голубой породы, на 4,84 % (Р<0,01) – чем у Сибирской породы и на 8,35 % – чем у котов породы Сфинкс.

Активность каталазы, которая нейтрализует перекиси, на более высоком уровне была установлена у котов Бенгальской породы, что на 8,55 мМ/мин/мл больше (Р<0,01) чем у котов Британской породы, на 11,54 мМ/мин/мл больше (Р<0,01) чем у Европейской породы, на 10,05 мМ/мин/мл больше (Р<0,01) чем у Мейн-кун, на 1,13 мМ/мин/мл больше чем у Персидской породы, на 7,2 мМ/мин/мл больше (Р<0,01) чем у Русской голубой породы, на 12,44 мМ/мин/мл больше (Р<0,001) чем у Сибирской породы и на 6,6 мМ/мин/мл больше (Р<0,05) чем у породы Сфинкс.

Следующей важной физиологической характеристикой криорезистентности спермы является переживаемость спермиев при температуре 38 °С в суховоздушном термостате. Чем дольше спермии выживают вне организма, тем выше вероятность результативного оплодотворения внутри организма, так как в половых путях самки спермии смогут пережить более длительное время из-за более благоприятных условий. Переживаемость спермиев в термостате была наибольшей у котов Бенгальской породы – более 4 часов, что дольше на 0,35 часа (Р<0,05) чем у Британской породы, на 1,81 часа (Р<0,001) – чем у Европейской породы, на 0,88 часа (Р<0,01) – чем у породы Мейн-кун, на 2,01 часа (Р<0,001) – чем у Персидской породы, на 0,75 часа (Р<0,01) – чем у котов Русской голубой породы, на 0,82 часа (Р<0,01) – чем у Сибирской породы и на 1,73 часа (Р<0,001) чем у котов породы Сфинкс.

Таким образом, показано, что активность ферментов антиоксидантной защиты и повышение уровня ДК и МДА способствует снижению физиологической способности спермиев котов выдерживать процесс замораживания-оттаивания. При несколько большем количестве конечных продуктов перекисного окисления липидов физиологические характеристики спермы котов Сибирской породы могут быть на сопоставимом уровне или даже лучше, чем у Русской голубой породы. Это указывает на наличие породных особенностей чувствительности спермиев к негативному действию функциональной недостаточности антиоксидантной системы у котов российской селекции.

Анализ корреляционных связей антиоксидантной системы с криорезистентностью спермы котов показал, что коэффициент корреляции СОД с подвижностью спермы после оттаивания составляет 0,05, а с выживаемостью спермиев 0,034. Коэффициент корреляции каталазы с подвижностью спермы после оттаивания составляет 0,21 (Р<0,001), а с выживаемостью спермиев 0,28 (Р<0,001); это означает, что чем выше активность каталазы, тем лучше криорезистентность спермы у котов. Коэффициент корреляции ГПО с подвижностью и выживаемостью спермы после оттаивания составляет 0,55 (Р<0,001); это означает, что ГПО сильнее влияет на криорезистентность спермы котов, чем каталаза. Коэффициент корреляции ДК с подвижностью спермы после оттаивания составляет минус 0,39 (Р<0,001), а с выживаемостью минус 0,46 (Р<0,001). Коэффициент корреляции МДК с подвижностью спермы после оттаивания составляет минус 0,45 (Р<0,001), а с выживаемостью минус 0,55 (Р<0,001). Отрицательные корреляционные связи означают то, что при увеличении значений ДК и МДА физиологические характеристики спермы будут ухудшаться.

Степень влияния породного фактора на функциональное состояние ферментов антиоксидантной защиты в сперме котов составил: 28,4 % (Р<0,001) на активность СОД; 49,6 % (Р<0,001) на активность каталазы; 45,2 % (Р<0,001) на активность ГПО. Степень влияния породного фактора на уровень конечных продуктов перекисного окисления липидов составил: 53 % (Р<0,001) на количество ДК и 63% (Р<0,001) на количество МДА в сперме.

Заключение. Проведенное исследование показало, что лучшая физиологическая активность антиоксидантной системы установлена нами у котов Бенгальской породы. На этом фоне у них наблюдалась лучшая криорезистентность спермы. Подвижность спермиев после оттаивания у котов Бенгальской породы была более 37 %, что на 3,41 % выше, чем у Британской породы, на 1,53 % – чем у Европейской породы, на 3,92 % (Р<0,05) – чем у породы Мейн-кун, на 15,62 % (Р<0,001) – чем у Персидской породы, на 4,89 % (Р<0,01) – чем у Русской голубой породы, на 4,84 % (Р<0,01) – чем у Сибирской породы и на 8,35 % – чем у котов породы Сфинкс. Переживаемость спермиев в термостате была наибольшей у котов Бенгальской породы – более 4 часов, что дольше на 0,35 часа (Р<0,05) чем у Британской породы, на 1,81 часа (Р<0,001) – чем у Европейской породы, на 0,88 часа (Р<0,01) – чем у породы Мейн-кун, на 2,01 часа (Р<0,001) – чем у Персидской породы, на 0,75 часа (Р<0,01) – чем у котов Русской голубой породы, на 0,82 часа (Р<0,01) – чем у Сибирской породы и на 1,73 часа (Р<0,001) чем у котов породы Сфинкс. При несколько большем количестве конечных продуктов перекисного окисления липидов физиологические характеристики спермы котов Сибирской породы могут быть на сопоставимом уровне или даже лучше, чем у Русской голубой породы. Это указывает на наличие породных особенностей чувствительности спермиев к негативному действию функциональной недостаточности антиоксидантной системы у котов российской селекции.