Физиологические особенности тромбоцитов у молодняка крупного рогатого скота холмогорской породы на протяжении фазы растительного питания

Кеуwords: calves, early ontogenesis, phase of plant nutrition, Kholmogorskaya breed, platelets, secretion, aggregation

Достаточность перфузии капилляров имеет большое значение для поддержания здоровья любого животного [2]. Очень важным для реализации этого процесса считается функциональный уровень тромбоцитов. Он способен в значительной мере воздействовать на ход микроциркуляции, существенно определять интенсивность анаболизма и, в конечном счете, выраженность хозяйственно полезных параметров сельскохозяйственных животных [8, 10]. Активность кровяных пластинок может испытывать динамику в любом возрасте под влиянием многих факторов среды [15], влияя на протекание основных жизненных процессов [7].

Несмотря на высокую физиологическую значимость состояния функциональных показателей тромбоцитов их особенности у телят разного возраста не могут считаться выясненными окончательно. Существует немного различных наблюдений, связанных с изучением активности тромбоцитов у крупного рогатого скота, принадлежащего к разным породам [4]. В этой связи доступные сведения не дают возможности сформировать четкое представление о возрастных особенностях активности тромбоцитов в разные возрастные периоды у крупного рогатого скота, относящегося к разным породам. Физиологическая значимость таких исследований связана с серьезной биологической ролью тромбоцитов, связанных с регуляцией интенсивности кровотока в мелких сосудах, что необходимо для сохранения здоровья животных и создания базиса для максимально возможного проявления их продуктивности [9]. В этой связи, существующие морфофункциональные отличия между породами крупного рогатого скота в плане выраженности основных продуктивных характеристик [11] делают необходимым исследование межпородных отличий активности тромбоцитов у растущих телят, принадлежащих к высокомолочным породам, в том числе к холмогорской породе.

Цель – проследить возрастные особенности функциональных возможностей тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы растительного питания.

Материал и методы исследований.

Работа выполнена при четком следовании этическим нормам, заложенным Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, которые могут использоваться в любых научных целях (утверждена в Страсбурге 18 марта 1986 г. и полностью подтверждена для практического применения в Страсбурге 15 июня 2006 г.).

Наблюдение осуществлено на 44 телятах растительного питания чистопородных по холмогорской породе. Молодняк, взятый в исследование, был получен после второй или третьей стельности от совершенно соматически здоровых коров. Все, взятые под наблюдение, телята прошли обследование за фазу их растительного питания четыре раза: на 91 сутки от рождения, в возрасте 6 месяцев, в возрасте 9 месяцев и в возрасте 12 месяцев их онтогенеза.

У молодняка отслеживали в кровяных пластинках уровень синтеза молекул тромбоксана и опосредованно определяли ферментативную активность тромбоцитарных циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. Для этого применяли три стандартные пробы переноса по стандартной методике [3]. У животных определяли содержание в тромбоцитах неметаболических аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата с регистрацией уровня их секреции в условиях воздействия на рецепторы тромбоцитов коллагена. В цитоплазме неактивных тромбоцитов устанавливали уровни содержания актина и миозина и выясняли количество этих белков в тромбоцитах, подвергшихся активации под влиянием аденозиндифосфата [3].

Регистрировали период наступления явлений агрегации тромбоцитов (АТ), при помощи визуального микрометода. Для данного исследования использовались традиционные индукторы, вызывающие тромбоцитарную агрегацию: аденозиндифосфат (в количестве 0,5 х 104 М), коллаген (в количестве 1:2 от основной суспензии), тромбин (в количестве 0,125 ед/мл), адреналин (в количестве 5,0x10-6 М) и ристомицин (в количестве 0,8 мг/мл). Регистрация АТ велась в условиях плазмы, богатой тромбоцитами, подвергнутой стандартизации по содержанию в ней тромбоцитов до величины 200x109 тромбоцитов на один литр. Уровень внутрисосудистой тромбоцитарной активизации выясняли в ходе фазовоконтрастного микроскопирования.

Математическая обработка полученных в ходе выполнения исследования цифровых данных выполнялась при помощи комплекса программ «Статистика для Windows V. 6.0», «Microsoft Excel». Отличия по сравниваемым показателям признавались достоверными при условии Р<0,05.

Результат исследований.

Содержание в крови телят тромбоцитов, обладающих оптимальной дискоидной формой, за период наблюдения за ними несколько снизилось (на 7,5 %), достигая в момент последнего наблюдения 65,1± 0,18 %. При этом в крови включенных в группу животных уровень активированных тромбоцитов увеличивался в целом на 16,3 % и достигал величины 34,9±0,17 %. У наблюдаемых телят общее количество находящихся во взвешенном состоянии в крови тромбоцитарных агрегатов мелкого размера, а также имеющих средний и крупный размер в течение четвертой фазы раннего онтогенеза повышалось на 20,4 и на 23,8 %, соответственно (Таблица 1).

Таблица 1 – Активность тромбоцитов в крови телят холмогорской породы на протяжении фазы растительного питания

Учитываемый в работе показатель	Возраст обследования, n=44, M±m
	91 cутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Уровень тромбоцитов-дискоцитов, %	70,0±0,10	69,1±0,27	67,5±0,22	65,1±0,18
Сумма активированных форм тромбоцитов, %	30,0±0,16	31,9±0,23	32,5±0,19	34,9±0,17 Р<0,05
Количество малых тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	5,4±0,16	5,7±0,15	6,2±0,11 Р<0,05	6,5±0,17 Р<0,01
Количество средних и больших тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	0,21±0,012	0,23±0,010 Р<0,05	0,25±0,013 Р<0,01	0,26±0,016 Р<0,01

Примечание: Р – достоверность возрастных изменений показателей по сравнению с уровнем 91 дневного возраста. В таблицах, приведенных далее по тексту, обозначения аналогичные.

У наблюдавшихся животных холмогорской породы на протяжении фазы растительного питания отмечен рост физиологических возможностей тромбоцитов. Так, у этих телят АТ, вызванная добавлением к плазме коллагена, ускорялась за время наблюдения на 14,2 %. У животных также отмечено постепенное сокращение периода развития АТ в ответ на все остальные испытанные индукторы: на аденозиндифосфат – на 13,9 %, на ристомицин на 10,1 %, на тромбин -на 10,1 % и на адреналин - на 10,4 %.

Весьма биологически важным механизмом сокращения времени развития АТ у молодняка холмогорской породы в течение фазы растительного питания следует считать повышение уровня тромбоцитарной тромбоксаногенерации. Об этом говорил рост на 16,5 % АТ, регистрируемой в ходе простой переносной пробы, опосредованно отражающей уровень выработки тромбоксана. Активизация АТ у телят была вызвана усилением функций их тромбоцитарных ферментов циклооксигеназы (на 9,5 %) и тромбоксансинтетазы (на 14,7 %). Об этом факте говорило найденное в работе увеличение на протяжении фазы растительного питания интенсивности АТ, регистрируемой в коллаген-аспириновой пробе до 89,6±0,16 % и нарастание АТ, возникающей в коллаген-имидазольной пробе до 56,8±0,11 % (Таблица 2).

Таблица 2 – Тромбоцитарная способность к агрегации у телят холмогорской породы в ходе фазы растительного питания

Учитываемый в работе показатель	Возраст обследования, n=44, M±m
	91 cутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Время развития AТ с АДФ, с	32,8±0,12	32,2±0,20	30,6±0,17	28,8±0,22 Р<0,05
Время развития AТ с коллагеном, с	28,2±0,18	27,5±0,16	26,3±0,12	24,7±0,15 Р<0,05
Время развития AТ с тромбином, с	44,5±0,19	42,5±0,15	41,9±0,16	40,4±0,19 Р<0,05
Время развития AТ с ристомицином, с	43,5±0,10	42,6±0,12	41,3±0,14	39,5±0,17 Р<0,05
Время развития AТ с адреналином, с	85,9±0,15	84,3±0,14	82,6±0,13	77,8±0,17 Р<0,05

На протяжении наблюдения количество аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата в тромбоцитах молодняка испытывало постепенный рост, который суммарно составил 10,2 и 10,7 %. Это сопровождалось у жтвотных активацией их секреции из гранулярного аппарата кровяных пластинок на 11,7 и 11,8 %.

В не испытавших активации тромбоцитах молодняка к концу наблюдения медленно повышалось количество белка актина на 12,0 % и увеличивался уровень белка миозина на 14,1 %. Это обеспечивало их выход на уровни соответственно 42,8±0,16 и 21,9±0,14 % общего белка в тромбоците. При этом, за время наблюдения за телятами в их агрегирующих тромбоцитах происходило нарастание дополнительного образования молекул актина на 11,0 % и молекул миозина на 13,2 %. (Таблица 3).

Современная физиология признает большую значимость гематологических показателей на протяжении всей жизни животного. По этой причине ее параметры рассматриваются как надежные маркеры для диагностики текущего состояния организма млекопитающих [14]. Признана их большая биологическая значимость в отношении длительного сохранения нормального функционального статуса организма животных, в том числе продуктивных.

В число весьма функционально важных гематологических показателей в настоящее время начали относить тромбоцитарные параметры. Однако их динамика в ходе онтогенеза у высокомолочных пород крупного рогатого скота остается еще недостаточно исследованной. Современные исследователи справедливо считают, что рассмотрение разных аспектов функционирования тромбоцитов способно дать возможность прояснить некоторые механизмы, обеспечивающие их молочную продуктивность, и прояснить пути ее экономически не затратного наращивания [1]. Есть мнение, что глубокое изучение аспектов функционирования тромбоцитов у молодняка молочных пород крупного рогатого скота позволит установить его динамику влияния на микроциркуляцию в ходе формирования основ их молочной продуктивности [12]. Понимание большой физиологической значимости решения данного вопроса явилось основой для проведения данного исследования на молодняке отечественной холмогорской породы.

Таблица 3 – Интратромбоцитарные характеристики у телят холмогорской породы на протяжении фазы растительного питания

Учитываемый в работе показатель	Возраст обследования, n=44, M±m
	91 сутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Количество АТФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109 тр.	5,80±0,017	6,08±0,017	6,19±0,012	6,39±0,014 Р<0,05
Количество АДФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109тр.	3,82±0,008	3,91±0,017	4,09±0,011	4,23±0,010 Р<0,05
Выраженность секреции АТФ,%	41,6±0,10	43,2±0,17	44,3±0,15	46,5±0,14 Р<0,05
Выраженность секреции АДФ,%	49,1±0,09	50,7±0,18	52,4±0,12	54,9±0,10 Р<0,05
Уровень восстановления АТ при проведении коллаген-аспириновой пробы, %	81,8±0,05	84,0±0,12	85,7±0,07	89,6±0,16 Р<0,05
Уровень восстановления АТ при проведении коллаген-имидазольной пробы, %	49,5±0,08	50,9±0,14	53,5±0,12	56,8±0,11 Р<0,05
Уровень АТ в простой пробе переноса, %	37,5±0,04	38,3±0,15	40,4±0,12	43,7±0,13 Р<0,05
Количество актина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	38,2±0,18	39,4±0,22	40,6±0,17	42,8±0,16 Р<0,05
Количество актина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	47,2±0,10	48,5±0,18	49,8±0,15	52,4±0,19 Р<0,05
Количество миозина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	19,2±0,07	19,7±0,12	20,4±0,10	21,9±0,14 Р<0,05
Количество миозина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	36,3±0,10	37,4±0,12	38,8±0,15	41,1±0,09 Р<0,05

Регистрация выраженности АТ под влиянием индукторов коллагена и ристомицина у наблюдавшихся телят холмогорской породы на протяжении всей фазы растительного питания показала постепенное сокращение времени ее развития, указывая на усиление у животных явлений адгезии кровяных пластинок. Данное явление происходило, видимо, за счет одновременной реализации не менее двух физиологических механизмов [1]. Один из них заключается в сокращении у телят времени наступления тромбоцитарной агрегации в ответ на добавление в плазму коллагена. Это, видимо, связано с увеличением на мембранах тромбоцитов телят холмогорской породы в этом возрасте количества молекул гликопротеидов типа Iа–IIа и типа VI, способных взаимодействовать с коллагеном. В качестве второго механизма усиления тромбоцитарной адгезии у наблюдаемых телят можно рассматривать повышение количества на мембранах их кровяных пластинок локусов с гликопротеидами типа Ib, способных обеспечить связывание с находящимся в плазме фактором Виллебранда. Реальность существования второго механизма нарастания интенсивности адгезии доказывалась постепенным ускорением у наблюдаемых телят на протяжении фазы растительного питания времени развития АТ в случае внесения в плазму ристомицина.

Выявленное у обследованного молодняка в конце раннего онтогенеза сокращение времени наступления агрегации тромбоцитов, по всей видимости, создает у них высокую степень защищенности организма от наступления кровопотери. Данная ситуация формируется у телят вследствие постепенного усиления работы большинства их регуляторных систем. В течение фазы растительного питания у телят холмогорской породы происходит постепенное ускорение развития АТ под влиянием сильных индукторов (коллагена и тромбина). Во многом это вызвано у телят увеличением количества молекул рецепторов к ним на тромбоцитарных поверхностях. Данные изменения тесно связаны с ростом активности в кровяных пластинках фосфолипазы С, ферментов фосфоинозитольного пути и ферментов, обеспечивающих фосфолирирование тромбоцитарных протеинов, входящих в кровяных пластинках в состав сократительной системы. Активация АТ в ответ на сильные индукторы всегда имеет в своей основе также усиление генерации в тромбоцитах молекул инозитолтрифосфата и интенсификацию поступления из плотных гранул ионов Са2+ в цитоплазму тромбоцитов. Эти изменения следует считать весьма серьезным стимулом ускорения самосборки и интенсификации процесса сокращения актомиозинового комплекса. В этой связи данные механизмы следует рассматривать в качестве механизмов, значимых для наступления у телят холмогорской породы в течение фазы растительного питания усиления агрегации с сильными агонистами и увеличения выраженности секреции из тромбоцитов

Установленное у взятых в исследование телят усиление процесса АТ в ответ на слабые агонисты этого процесса (аденозиндифосфат и адреналин) указывала на активацию у них реализующих ее механизмов на протяжении фазы растительного питания. Видимо, постепенное ускорение с ними АТ было возможно в результате повышения на поверхности тромбоцитов молодняка холмогорской породы количества рецепторов, способных реагировать с фибриногеном (GPIIb-IIIа) и усиления ферментативных свойств тромбоцитарной фосфолипазы А 2 . Развивающееся вследствие этого небольшое увеличение выброса из тромбоцитарных мембран молекул арахидоната, обеспечивало накопление материала для генерации тромбоцитарного тромбоксана А 2 [6]. Интенсификация генерации тромбоксана в тромбоцитах телят на протяжении фазы растительного питания, отмеченная в ходе исследования при помощи проб переноса, имела в своей основе также активацию в тромбоцитах ферментов трансформации арахидоната – циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. Весьма существенным механизмом постепенного ускорения процесса АТ у телят холмогорской породы в ответ на слабые агонисты также, видимо, является нарастание в их тромбоцитах базального и стимулированного количества актина и миозина, способствующего усилению секреторного выброса аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата из тромбоцитарных гранул [13].

Выраженность изменений тромбоцитов непосредственно в крови телят холмогорской породы в течение фазы растительного питания была выяснена в ходе применения фазовоконтрастной микроскопии. Найденное у животных в ходе фазы растительного питания их раннего онтогенеза постепенное увеличение в крови уровня активированных кровяных пластинок, с одной стороны, говорило о росте сенситивности их тромбоцитов к растворенным в плазме агонистам процесса тромбоцитарной агрегации, а, с другой стороны, это указывало на повышение у них уровня доступности коллагена субэндотелия их сосудов, способного быстро активировать интактные кровяные пластинки. Кроме того, найденное увеличение у наблюдавшихся телят внутрисосудистой активности тромбоцитов было связано с повышением в их крови в конце раннего онтогенеза содержания в плазме растворимых стимуляторов тромбоцитарной агрегации [4, 13]. Все эти причины, видимо, были существенны для нарастания в крови телят холмогорской породы за время фазы растительного питания числа свободноциркулирующих агрегатов кровяных пластинок.

Выявленные изменения, видимо, связаны с процессами роста и строго растительным составом корма. Найденные изменения способствовали минимизации риска развития кровотечений при отсутствии опасности локального перекрытия тромбоцитарными агрегатами мелких сосудов в разных тканях. Видимо, наступающее некоторое повышение с возрастом внутрисосудистой агрегации тромбоцитов у завершающего рост молодняка холмогорской породы является особенностью его возрастной динамики системы гемостаза. Необходимость сохранения у него четкого баланса между процессами, носящими протромботическую и антитромботическую направленность, видимо, обеспечивается ростом гемостатических возможностей стенок всех их сосудов. Ясно, что оптимум функционирования первичного гемостаза у холмогорских телят обеспечивается балансом между тромбоцитами и активностью стенок сосудов на высоком уровне функционирования гемостатических процессов. Очевидно, это является породной особенностью, заключающейся в высоком уровне функциональной напряженности в первичном гемостазе, формирующей основу у них баланса между протромботическими и антитромботическими механизмами.

Заключение. Для молодняка холмогорской породы в течение фазы растительного питания свойственно некоторое усиление активности тромбоцитов. Нарастание у них функциональных возможностей тромбоцитов телят холмогорской породы связано с постепенным усилением в конце их раннего онтогенеза процессов, реализующих процессы тромбоцитарных адгезии, агрегации и секреции. По всей видимости, найденная динамика активности тромбоцитов у телят холмогорской породы на протяжении фазы растительного питания, направлена на поддержание гемостаза в крови и способствует адаптации организма животного к условиям завершения его роста и развития.

Резюме

Исследование посвящено оценке уровня функциональных возможностей тромбоцитов у телят холмогорской породы в течение фазы растительного питания. Работа проведена на 44 здоровых животных холмогорской породы, которых получили после 2-3 стельности от соматически здоровых коров. У обследованного молодняка обнаружено постепенное ускорение наступления агрегации тромбоцитов в ответ на все примененные ее агонисты. В крови у обследованных телят найдена тенденция к понижению уровня дискоцитов и рост содержания в ней активных тромбоцитов и их агрегатов. Зарегистрированное усиление гемостатических возможностей тромбоцитов было возможно у наблюдавшегося молодняка в результате роста образования в них тромбоксана, увеличения количества содержащихся аденозинфосфатов, повышения уровня в них белков актина и миозина и ускорения процесса их самосборки в случае активизации кровяных пластинок. Найденное у телят холмогорской породы прогрессивное усиление гемостатических параметров кровяных пластинок, видимо, имеет свое адаптивное значение для реализации у них фазы растительного питания.