Физиолого-биохимические характеристики клеточной культуры Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob. при воздействии мета-хлорбензгидрилмочевины

Мета-хлорбензгидрилмочевина (МХБМ) - индуктор монооксигеназной системы человека, ключевые ферменты которой относятся к суперсемейству цитохромов Р-450 (CYP). В настоящее время отсутствуют сведения о роли МХБМ в регуляции жизнедеятельности растений, однако показано участие CYP в превращении вторичных метаболитов, например флавоноидов (Фл), и большинства фитогормонов. Горькуша оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) - малоизученный вид растений. Ее клеточная культура, в соответствии с нашими данными, 2-кратно увеличивает суммарное количество эндогенных Фл при переходе от экспоненциального роста в стационарную фазу. В настоящем исследовании впервые показаны статистически значимые (p £ 0,05) различия в ответных ростовых реакциях каллусной культуры S. orgaadayi на действие МХБМ в разных концентрациях. Выявлено, что изменение ростового индекса по сырой и сухой массе обусловлено изменением объема и формы клеток, а также частоты встречаемости разных групп клеток. Впервые исследована динамика содержания флавоноидов, сопровождающая изменения роста культуры под влиянием МХБМ. Целью работы было определение роли мета-хлорбензгидрилмочевины в накоплении флавоноидов и изменчивости цитоморфологических характеристик (линейных размеров, объема и формы клеток, частоты встречаемости разных групп клеток, ростового индекса по сырой и сухой биомассе каллуса) каллусной культуры горькуши оргадаай. Каллусную культуру, полученную на основе семядольных эксплантов из стерильных проростков, многократно пассировали на модифицированной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением сахарозы, витаминов и регуляторов роста (0,8 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л 6-бензинаминопурина). Культуру выращивали в темноте при температуре 22-24 °С на среде МС с добавлением регуляторов роста и МХБМ (ООО «Синтегал», Россия) в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10; 100 мкМ. В контроле МХБМ не вносили. Продолжительность субкультивирования составила 30 сут, 2/3 растительного материала использовали для определения сырой и сухой биомассы с последующим выделением флавоноидов, 1/3 материала фиксировали в растворе Кларка в течение 2 сут. Для приготовления микропрепаратов каллусную культуру мацерировали в 3 н. растворе соляной кислоты при постоянном встряхивании до получения однородной суспензии клеток. Цитофотометрический анализ осуществляли с помощью световой микроскопии (видеокамера Moticam 2300, «Motic», Испания) с программным обеспечением. Определяли размеры 100 клеток для каждого варианта, оценивали их форму, вычисляли объем. Для расчета ростового индекса (РИ) определяли начальную (начало субкультивирования, М0) и конечную сырую или сухую массу каллусов (на 30-е сут субкультивирования, М30) и выражали в процентах к контролю: РИ = (М30 - М0)/М0. Количественное определение содержания суммы Фл в каллусной культуре осуществляли на основе их комплексообразования с хлоридом алюминия и последующего измерения оптической плотности окрашенных растворов (спектрофотометр UV-1650, «Shimadzu Corp.», Япония). В результате исследований установлено дозозависимое действие МХБМ на рост клеток за счет их деления (при 0,1 мкМ) и растяжения (1-100 мкМ), которое сопровождалось увеличением РИсыр и РИсух каллусной культуры соответственно в 2,1-3,5 и 1,5-2,9 раза (р сыр, отмеченное на среде с 1 мкМ МХБМ, происходило на фоне снижения суммы Фл на 83 %. Препарат МХБМ можно использовать в растительной биотехнологии в качестве модулятора роста клеток каллусных культур за счет снижения содержания ингибирующих рост метаболитов. Для активации клеточного деления наиболее предпочтительна доза 0,1 мкм МХБМ, тогда как для изменения содержания Фл, 2-кратно увеличивающих биомассу культуры, следует применять 100 мкМ МХБМ.