Физиолого-биохимические характеристики клеточной культуры Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob. при воздействии мета-хлорбензгидрилмочевины

Растения, в отличие от животных и человека, характеризуются способностью синтезировать вторичные метаболиты. Среди последних выделяют многочисленную группу флавоноидов (Фл), в которой изучено более 6900 представителей (1). Эти метаболиты синтезируются из п-кумароил-КоА последовательным воздействием различных ферментов, которые, как полагают, образуют слабо связанные с мембранами (например, с эндоплазматическим ретикулумом) упорядоченные макромолекулярные белковые комплексы — флавоноидные метаболоны (1, 2). При синтезе специфических Фл во время роста растений и в реакциях на стрессоры важную роль играет определенная локализация и продолжительность взаимодействий между специфическими белками (1, 3). Фл выполняют следующие физиологические функции: защиту от листогрызущих насекомых, патогенных микроорганизмов, ультрафиолетового излучения и света высокой интенсивности, привлечение насекомых-опылителей, ингибирование образования активных форм кислорода (АФК), участие в прорастании пыльцы, биологическую коммуникацию в ризосфере (нодуляция), повышение эффективности извлечения питательных веществ во время старения растения и его органов (3-6). Они способны к хелатированию металлов, что может служить механизмом in vivo для снижения токсичности (3). Кроме того, Фл выступают в качестве регуляторов развития, участвующих в изменении транспорта фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и его метаболизма (7).

Так как Фл не синтезируются в организме животных и человека, эти соединения служат незаменимыми пищевыми компонентами. Природные Фл имеют низкую токсичность, поэтому их используют для профилактики и лечения различных патологий (8). Пищевые Фл с антиоксидантной активностью снижают частоту возникновения атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета, тромбоза, воспаления при артрите, нейроде-генеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркинсона), ожирения, гиперлипидемии и гипертонии (4). Кверцетин проявляет антипроли-феративный эффект в отношении линий раковых клеток (9). Фл используют как сырье для промышленного производства фармакологических и косметических субстанций, в связи с чем возникает вопрос о контроле содержания Фл в растениях.

В качестве индукторов биосинтеза Фл рассматриваются не только негативные биотические и абиотические воздействия, но и эндогенные факторы, например гормональный баланс клеток, связанный с возрастом растения, его органов и клеточных культур (5, 10-12). Среди ферментов, участвующих в модификации Фл, выделяют цитохром-Р-450-зависимые монооксигеназы (CYP) — компоненты флавоноидных метаболонов (1, 2, 13). Индуктором цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназной системы человека может служить мета-хлорбензгидрилмочевина (МХБМ) (14), однако сведения о роли МХБМ в регуляции жизнедеятельности растений отсутствуют.

Изучение молекулярных механизмов действия веществ в растительном организме затруднено вследствие присутствия многочисленных структурных элементов на клеточном, тканевом и органном уровнях, а также большого числа происходящих в них метаболических процессов. В связи с этим наиболее удачным модельным объектом могут служить гетеротрофные клеточные культуры, упрощенные по строению и не проявляющие фотосинтетической активности.

В настоящем исследовании впервые показаны статистически зна- чимые (p < 0,05) различия в ответных ростовых реакциях каллусной культуры горькуши оргадаай (Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) на действие МХБМ в разных концентрациях. Выявлено, что изменение ростового индекса по сырой и сухой массе обусловлено изменением объема и формы клеток, а также частоты встречаемости разных групп клеток. Впервые исследована динамика содержания флавоноидов, сопровождающая изменения роста культуры под влиянием МХБМ.

Целью работы было определение роли мета-хлорбензгидрилмоче-вины в накоплении флавоноидов и изменчивости цитоморфологических характеристик (линейных размеров, объема и формы клеток, частоты встречаемости разных групп клеток, ростового индекса по сырой и сухой биомассе каллуса) каллусной культуры горькуши оргадаай.

Методика. Производное мочевины — мета-хлорбензгидрилмочевина (галодиф, Galodif, CAS: 124057-07-4) было синтезировано в Томском политехническом университете (15), правообладатели препарата ООО «Синте-гал» и ООО «Наука, Техника, Медицина» (Россия). В работе использовали разведения матричного 100 мМ спиртового раствора МХБМ в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10; 100 мкМ.

Каллусную культуру многолетнего лекарственного растения горькуши оргадаай S. orgaadayi , полученную на основе семядольных эксплантов из стерильных проростков, многократно пассировали на модифицированной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением сахарозы, витаминов и регуляторов роста 0,8 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфенок-сиуксусная кислота) и 0,5 мг/л 6-БАП (6-бензинаминопурин) (16). Культуру выращивали в темноте при температуре 22-24 ° С на среде МС с добавлением регуляторов роста и МХБМ, в контроле МХБМ не вносили.

Продолжительность субкультивирования составила 30 сут, ²/ з растительного материала использовали для определения сырой и сухой биомассы с последующим выделением флавоноидов, 1 / 3 материала фиксировали в растворе Кларка (96 % этиловый спирт:ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) в течение 2 сут. Затем материал отмывали от фиксатора 96 % раствором этилового спирта (3 раза по 30 мин) до исчезновения запаха уксусной кислоты и хранили в 70 % растворе этанола при 4 ° С (17). Для приготовления микропрепаратов каллусную культуру мацерировали в 3 н. растворе соляной кислоты при постоянном встряхивании до получения однородной суспензии клеток.

Цитофотометрический анализ осуществляли с помощью световой микроскопии (видеокамера Moticam 2300, «Motic», Испания) с программным обеспечением. Для каждого варианта измеряли размеры (L — длина, D — ширина) 100 клеток. По соотношению L/D оценивали форму клеток: 1,0 <  L/D <  1,14 — округлые, 1,15 <  L/D <  1,94 — овальные, L/D >  1,95 — вытянутые. Объем клеток вычисляли по формуле Ю.А. Цельникер (18) с учетом рассчитанного автором поправочного коэффициента (k), который зависит от L/D. При L/D > 2,5 для определения объема клеток (V, мкм³) применяли формулу цилиндра V = n (D/2)²Lk, при L/D <  2,5 — формулу эллипсоида вращения V = 4/3 n L/2(D/2)². Для расчета ростового индекса (РИ) определяли начальную (начало субкультивирования, М е ) и конечную сырую или сухую массу каллусов (на 30-е сут субкультивирования, М 30 ) и выражали в процентах к контролю: РИ = (М 30 - М с )/М 0 .

Количественное определение содержания суммы Фл в каллусной культуре S. orgaadayi осуществляли на основе их комплексообразования с хлоридом алюминия и последующего измерения оптической плотности окрашенных растворов (спектрофотометр UV-1650, «Shimadzu Corp.», Япония) (19). Навеску сухого растительного сырья (1 г) трижды (по 60 мин) экстрагировали 70 % этиловым спиртом на кипящей водяной бане, экстракты объединяли. Аликвоту объединенного растительного экстракта выдерживали в течение 40 мин в присутствии хлористого алюминия и уксусной кислоты. Раствор сравнения, не содержащий хлористого алюминия, готовили для каждой пробы отдельно.

После взаимодействия веществ определяли оптическую плотность опытного раствора и стандартного раствора рутина при X = 415 нм. Вычисляли суммарное содержание Фл в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (Х фл ):

Х ф_л = OD x • K x • т рут • 100 • 100 • СП рут ^{- 1} • К рут ^{- 1} • т х ^{- 1} • (100 - W) ^{- 1}, где ОП х — оптическая плотность исследуемого раствора; ОП рут — оптическая плотность раствора рутина; т х — сырья масса, г; т рут — масса рутина, г; K x — коэффициент разбавления исследуемого раствора (1250); К рут — коэффициент разбавления раствора рутина (2500); W — потеря в массе при высушивании сырья, %.

При статистической обработке результатов в программе IBM SPSS Statistics («IBM Corporation», США) для Windows использовали параметрический t -критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манна-Уитни для парного сравнения параметров групп. На рисунках представлены средние арифметические значения ( М) для ростовых ( n = 100) и биохимических ( n = 5) параметров с двухсторонними доверительными интервалами ( М ±1,96 SEM). Различия между значениями, отмеченные разными буквами, статистически значимы при р < 0,05.

Результаты. В проведенных экспериментах изучали зависимость морфогенеза и аккумуляции Фл у медленнорастущей каллусной культуры S. orgaadayi, полученной на основе семядолей, от концентрации МХБМ в питательной среде (рис. 1). На выбор культуры повлияли наши предварительные исследования (20), показавшие 3-кратное превышение содержания Фл (0,026±0,006 % к сухой массе) на 25-е сут в медленнорастущей культуре по сравнению с активно ростков S. orgaadayi.

растущей, полученной на основе гипокотилей про-

Б

Рис. 1. Формула мета-хлорбензгидрилмочевины (А) и каллусная культура клеток, полученная на основе семядольных эксплантов проростков горькуши оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) (Б) .

А

При выборе времени субкультивирования каллуса руководствовались данными о приросте сырой массы у контрольной культуры. Рост каллус- ной культуры описывался S-образной кривой с несколькими фазами ростового цикла: лаг-фазой, или периодом медленного роста, в течение первых 10 сут, логарифмической фазой с длительностью 15 сут, 5-суточной фазой замедления и, начиная с 30-х сут, стационарной фазой (данные не приведены). На 25-е сут субкультивирования РИсыр культуры в контроле составил 2,32±0,70. Эксперимент проводили до 30-х сут с целью перехода культуры в стационарную фазу роста и увеличения выхода вторичных метаболитов Фл, что согласуется с данными других авторов (12).

Добавление МХБМ в питательную среду в концентрациях 0,1100 мкМ увеличило прирост биомассы каллусной культуры. РИ сыр и РИ сух увеличивались соответственно в 2,1-3,5 и 1,5-2,9 раза (р < 0,05) относительно контроля (рис. 2). Действие 0,01 мкМ МХБМ не изменило РИ сыр , но снизило РИ сух на 20 % (р < 0,05). Наибольшие значения РИ сыр и РИ сух были отмечены при использовании 1 мкМ МХБМ. При этом в опыте каллусная культура отличалась от контрольной более светлой и рыхлой консистенцией.

Концентрация мета-хлорбензгидрилмочевины, мкМ

Рис. 2. Относительный прирост сырой (1) и сухой (2) биомассы каллусной культуры горькуши оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) в зависимости от концентрации мета-хлор-бензгидрилмочевины. Различия между значениями каждого показателя, отмеченные разными буквами, статистически значимы при р < 0,05 ( М ±1,96 SEM).

Цитологический анализ выявил морфологическую гетерогенность популяции клеток культуры S. or-gaadayi (рис. 3, 4). Мы выделили группы клеток, которые различались по форме (округлые, овальные и вытянутые) и размеру (мелкие, средние и крупные). Мелкие клетки (9,0-35,7 тыс. мкм3) мы рассматривали как ме ристематические делящиеся, средние (35,75-75,94 тыс. мкм3) — как растущие, крупные (76,0323,2 тыс. мкм3) — как завершившие рост.

Контрольная каллусная культура на 30-е сут характеризовалась боль шей частотой встречаемости мелких клеток, чем средних и крупных соответственно в 1,6 и 3,4 раза (рис. 3, Б). Средний объем мелких клеток составлял 20,2±2,3 тыс. мкм3, тогда как средних и крупных — соответственно 51,5±1,4 и 112,1±2,6 тыс. мкм3 (рис. 3, А).

Результатом действия МХБМ на каллусную культуру было изменение роста клеток. При концентрации 0,1 мкМ количество мелких меристематических клеток увеличивалось на 16 % относительно контроля, что могло свидетельствовать об усилении клеточного деления (см. рис. 3, Б). Одновременно усредненный объем клеток крупных размеров уменьшался на 31 % по сравнению с контролем (см. рис. 3, А), что указывало на торможение процессов растяжения клеток. С повышением концентрации МХБМ увеличивалась частота встречаемости клеток среднего (на 55 и 30 % соответственно при 1 и 10 мкМ) и крупного (на 50 и 57 %, р < 0,05 при 1 и 100 мкМ) размеров (см. рис. 3, Б) и увеличивался объем крупных (на 61 %, р < 0,05 при 10 мкМ) и мелких (на 18 %, р < 0,05 при 100 мкМ) клеток относительно контроля. На этом фоне уменьшалось количество мелких клеток (на 49, 20 и 30 %, р < 0,05 соответственно при 1, 10 и 100 мкМ) и их объем (на 22 и 17 %, р < 0,05 при 1 и 10 мкМ) (см. рис. 3).

Концентрация мета-хлорбензгидрилмочевины, мкМ

Рис. 3. Объем клетки (А) и частота встречаемости клеток разного размера (Б) в каллусной культуре горькуши оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) в зависимости от концентрации мета-хлорбензгидрилмочевины: 1 — мелкие, 2 — средние, 3 — крупные клетки. Различия между значениями каждого показателя, отмеченные разными буквами, статистически значимы при р < 0,05.

Рис. 4. Форма (А) и частота встречаемости (Б) клеток разной формы и размеров в каллусной культуре горькуши оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) в зависимости от концентрации мета-хлорбензгидрилмочевины: а — 0 (контроль); б — 0,01 мкМ; в — 0,1 мкМ; г — 1 мкМ; д — 10 мкМ; е — 100 мкМ.

Под действием МХБМ увеличивалась доля округлых клеток всех размеров (рис. 4, Б). Наибольшие изменения наблюдали в частоте встречаемости мелких клеток (повышение в 2,5 раза, р < 0,05) при концентрации 0,1 мкМ МХБМ, средних и крупных клеток (рост соответственно в 1,7 и 2,3 раза, р < 0,05) — при 1 мкМ МХБМ. Наибольшая (увеличенная в 3,3 раза, р < 0,05) частота встречаемости крупных клеток округлой формы была отмечена при 100 мкМ МХБМ.

Изменение ростовых процессов в культуре могло свидетельствовать об изменении количества эндогенных веществ, осуществляющих регуляцию роста. Среди последних называют Фл, модулирующие гомеостаз раститель ных гормонов ауксинов (7). Мы установили, что суммарное содержание

Фл у контрольной культуры в процессе субкультивирования на стационарной стадии (30-е сут) составило 0,049±0,008 % к сухой массе, что на 50 % (р < 0,05) больше, чем на 25-е сут в точке перегиба логарифмического участка кривой роста. Эти данные свидетельствуют о замедлении роста на фоне повышения содержания эндогенных Фл.

Концентрация мета-хлорбензгидрилмочевины. мкМ

Рис. 5. Содержание суммы флавоноидов в каллусной культуре горькуши оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) в зависимости от концентрации мета-хлорбензгидрилмочевины. Различия между значениями, отмеченные разными буквами, статистически значимы при р < 0,05 ( М ±1,96 SEM).

При действии МХБМ происходило изменение суммарного содержания Фл по сравнению с контролем (рис. 5). Впервые показано, что уменьшение (на 80-95 %) суммарного количества эндогенных Фл под действием МХБМ сопровождалось активацией ростовых процессов в раститель ных клетках S. orgaadayi in vitro. Содержание суммы Фл максимально снижалось при низких концентрациях МХБМ и сохранялось на уровне контроля при 100 мкМ МХБМ. Максимальный (в 3,5 раза) прирост биомассы, отмеченный при 1 мкМ МХБМ, происходил на фоне снижения суммы Фл на 83 %.

Таким образом, в нашем исследовании было показано влияние МХБМ на рост каллусной культуры S. orgaadayi, что, вероятно, обусловлено его действием на растяжение и деление клеток. Дозозависимые изменения в накоплении биомассы культуры (см. рис. 2) сопровождались изменением частоты встречаемости клеток разных размеров и формы (см. рис. 3, 4). Действие МХБМ в самой низкой концентрации (0,01 мкМ) снижало РИсух, что могло определяться снижением объема крупных клеток на 23 % при равном контролю соотношении ранжированных по размеру групп клеток. Наибольшие РИсыр и РИсух культуры, отмеченные при действии 1 мкМ МХБМ, сопровождались повышенной частотой встречаемости средних и крупных клеток и снижением доли мелких клеток (см. рис. 3, Б). Концентрация 0,1 мкМ МХБМ оказывала меньший эффект, чем 1 мкМ МХБМ, что проявлялось в повышении частоты встречаемости мелких клеток и, соответственно, в снижении доли средних и крупных.

Наиболее активными концентрациями МХБМ в регуляции роста каллусной культуры горькуши оргадаай были 0,1-10 мкМ, под действием которых увеличивалось число меристематических округлых мелких клеток.

Ускорение роста сопровождалось изменением вторичного метаболизма, что выразилось в снижении суммарного количества Фл на 80-95 % (р < 0,05) относительно контроля (см. рис. 5). Действие МХБМ в высокой концентрации 100 мкМ достоверно увеличивало прирост биомассы культуры, существенно не меняя содержание Фл. Дозозависимая динамика роста и содержания Фл под действием МХБМ, вероятно, может свидетельствовать об изменении функционирования ферментов, участвующих в метаболизме Фл. На модификацию Фл в клеточной культуре указывают данные других авторов (21), изучавших комплексное воздействие экзогенных факторов (кадмия и глифосата) на суммарное содержание фенольных соединений, которое возрастало на фоне снижения количества фенилпропаноидов и флавоноидов.

На рост каллусной культуры могли оказывать действие Фл с разными свойствами. Наряду с антиоксидантными свойствами катехинов и кверцетина некоторые Фл в высоких дозах могут проявлять прооксидант-ную активность и повреждать клетки (8).

Показано влияние Фл на регуляцию клеточного цикла (22). В качестве возможных механизмов называют непосредственное взаимодействие Фл (например, кверцетина) с протеинкиназами Raf и MEK, обусловливающими проведение митотических сигналов, или их связывание с рецептором AhR и образование комплекса с ARNT, стимулирующего транскрипцию ингибитора клеточного цикла CDKNB1 (22, 23).

Кроме того, возможно и опосредованное действие Фл на рост, связанное с изменением транспорта ауксинов и их метаболизма. Известно, что пространственно-временное распределение ауксинов, обусловленное механизмами полярного транспорта, играет решающую роль в их физиологических эффектах (24). На примере мутантов tt4 показано, что дефицит Фл усиливает поток ИУК (25). Считается, что флавонолы непосредственно модулируют транспорт ИУК — процесс, который снижается в сверхаккумули-рующем кемпферол мутанте tt7 , дефектном по F39H (25). Негликозилиро-ванные кемпферол и кверцетин конкурируют с ингибитором транспорта ауксина l-N-нафтилфталаминовой кислотой за высокоаффинный сайт связывания комплекса, содержащего белки PGP1, PGP2 и MDR1/PGP19, которые принадлежат к АТФ-связывающим кассетным переносчикам. В то же время Фл выступают в качестве регуляторов ИУК-оксидазы, участвующей в деградации ИУК: Фл с о-гидроксилами в ядре В (кверцетин, мирицетин, лю-теолин) ингибируют активность фермента, тогда как Фл с п-гидроксилами (апигенин, нарингенин, нарингин) стимулируют его (26). В итоге первая группа Фл стимулирует рост, а вторая — ингибирует его.

В то же время неотъемлемым этапом нормального роста и развития растений считается окисление Фл, которое связано с деятельностью растительных пероксидаз или других ферментов (27, 28). В результате окисления Фл способны проявлять прооксидантное действие, которое выражается в повреждении биологических структур и общем снижении жизнеспособности клеток организма (28).

Исследуемый нами препарат МХБМ может регулировать активность гемсодержащих ферментов семейства цитохромов P-450 (CYP), принадлежащих к группе монооксигеназ у человека. Ферменты этой группы обнаружены во всех царствах и катализируют разнообразные химические реакции (13, 25). Изменения роста клеток культуры S. orgaadayi под действием МХБМ, сопровождавшиеся изменением содержания Фл, вероятно, также можно объяснить регуляцией функционирования CYP, участвующих в метаболизме Фл (2). Показано, что CYP82D кодирует флавон-6-гидрокси-лазу и 7-деметилазу и отвечает за биосинтез Фл в сладком базилике, тогда как CYP75 регулирует экспрессию флавоноид-3‘-гидроксилазы и флаво-ноид-3‘,5‘-гидроксилазы, которые участвуют в синтезе большинства антоцианов, в красном винограде (13). CYP93G1, ближайший гомолог CYP93G2 в рисе, — это флавон-синтаза II (FNSII), которая катализирует прямое превращение флаванонов в флавоны (30).

Другими эндогенными факторами роста клеток культуры горькуши могли выступать фитогормоны, в регуляции метаболизма которых также участвуют CYP. Например, CYP79B2/B3 ответствен за превращение L-триптофана (L-Trp) в индол-3-ацетальдоксим в альтернативном L-Trp-зависи-мом пути биосинтеза ауксинов (13), цитокинин-гидроксилазы CYP735A1 и CYP735A2 катализируют биосинтез транс-зеатинов, а CYP72C1 инактивирует брассиностероиды у Arabidopsis thaliana (13, 25).

Возможны и мембранные механизмы действия МХБМ на растительные клетки по аналогии с клетками человека. Такие механизмы могут быть связаны с блокадой быстрых натриевых каналов нейронов, ограничивающей распространение электрического потенциала. В результате МХБМ за счет регулирования водно-электролитного баланса стабилизирует концентрационный градиент ионов, а также препятствует изменению мембранной проницаемости и трансмембранного потенциала клетки. Наряду с этим МХБМ усиливает процессы микросомального окисления, проявляя детоксицирующее действие в клетках.

В соответствии с полученными нами данными, высокое содержание Фл на 30-е сут субкультивирования обусловливало завершение активного роста клеток каллуса у S. orgaadayi в контрольном варианте, что согласуется с данными по увеличению аккумуляции Фл на стационарной стадии клеточной культуры (11, 12) и в завершивших рост листьях растений Lactuca sativa L. (5). Также показано (12, 29), что в процессе длительного культивирования клеток суспензионной культуры повышается окислительный статус (накопление АФК) и происходит активация антиоксидантных ферментов и вторичных метаболитов. В связи с этим следует ожидать, что действие МХБМ увеличивает биомассу культуры, вероятно, за счет снижения количества Фл и, соответственно, увеличения продолжительности ростовой активности клеток.

На основе наших результатов и данных других авторов (2, 12, 25, 2830), полученных при исследовании растений и их клеточных культур, можно предполагать влияние МХБМ на активность ферментов, регулирующих содержание Фл и фитогормонов, а также ферментативных антиоксидантов.

Итак, используемая в эксперименте медленнорастущая каллусная культура горькуши оргаадай, полученная из семядольного экспланта, продуцировала флавоноиды. Введение экзогенной мета-хлорбензгидрилмоче-вины (МХБМ) в питательную среду в концентрации от 0,01 до 10 мкМ обусловливало снижение содержания вторичных метаболитов в каллусной культуре. Уменьшение суммарного содержания флавоноидов приводило к активации ростовых процессов. Происходило накопление биомассы каллуса и повышение ростового индекса культуры с максимумом при 1 мкМ МХБМ. Дальнейшее увеличение концентрации МХБМ снижало темпы прироста биомассы. Рост биомассы культуры сопровождался изменением частоты встречаемости разных типов клеток и размеров. При действии 0,1 мкм МХБМ увеличивалось число мелких меристематических клеток, а начиная с 1 мкМ МХБМ, возрастала частота встречаемости округлых и овальных клеток среднего и крупного размера при уменьшении встречаемости мелких клеток. При этом клетки достигали наибольших размеров при концентрации 10 мкМ, а максимальное число крупных клеток отмечали при 100 мкМ МХБМ. Такая динамика указывала на увеличение скорости деления клеток при низких концентрациях и растяжения клеток — при средних и высоких концентрациях МХБМ. Полученные данные свидетельствуют о дозозависимом действии МХБМ на рост клеток через изменение содержания флавоноидов.