Флавоноиды листьев Rhamnus pallasii Fisch. & C. A. Mey.

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

Род Rhamnus L. (Крушина) из семейства Rhamnaceae (Крушиновые) объединяет 125 (или 200) видов, распространенных по всему умеренному северному полушарию к югу от Бразилии и Южной Африки. Из них в Европе насчитывается 13, на Кавказе 8, в Азербайджане 5 видов [1]. Виды рода Rhamnus широко используются в народной и научной медицине как слабительные, мочегонные и антигипертензивные средства при лечении ряда заболеваний, а также печеночных и дерматологических осложнениях. Экстракты различных органов показывают сильную антирадиантную, антимутагенную, антигентоксическую и антибактериальную активности. Экстракты из листьев модулируют экспрессию генов, участвующие в регенерации ДНК [2].

Химический состав различных органов видов крушина как лекарственное сырье был исследован многими исследователями. В плодах растения были найдены антоцианы, антрахиноны [3, 4] в листьях и коре установлены производные антрахинонов, горькие вещества, алкалоиды [5], фенолы [6], флавоноиды: тригликозиды кверцетина, кемпферола, рамнетина, эмодин [7]. Кроме того, в составе растения найдены глюкофрангулин и полифенолы, содержание которых в зависимости от органа изменяется от 0,02–9,20 до 2,68– 8,50%. Литературные данные свидетельствуют о том, что виды рода Rhamnus являются богатым источником флавоноидов и антраглюкозидов [3, 4].

Установлено, что фармакологическое действие препаратов, полученных из органов крушины, связано с присутствием в их составе таких биологически активных веществ как флавоноиды, антрахиноны, катехины, антоцианы, дубильные вещества [2, 8]. Наряду с антисклеротическим и антиаритмическим действиями, эти вещества обладают также антибактериальной, цитотоксической, гепатопротекторной, антиаллергической, антивирусной, противовоспалительной и антиоксидантной активностями [6, 8–10].

Как известно, многие заболевания являются результатом окислительного повреждения в организме. Свободные радикалы участвуют в перекисном окисление липидов, которые вызывают ухудшение питания, старение организма, развитие рака, а также окисление биомолекул (белков, ДНК, и др.) что приводит к повреждению и гибели клетки [10]. Установлено, что экстракт из Rhamnus alaternus L. и его флавоноиды обладают сильными антиоксидантными свойствами [3, 5, 11].

Анализ литературных данных показывает, что несмотря на многие полезные, и особенно лечебные свойства видов рода Rhamnus как в фитохимическом, так и фармакологическом аспекте они изучены недостаточно. По вышеуказанным аспектам совсем не изучены виды, распространенные в Азербайджане. В связи с этим целью данной работы является исследование качественного состава флавоноидов листьев Rhamnus pallasii , произрастающего в Азербайджане.

Материалы и методы исследования

Материал исследования — листья Rhamnus pallasii . Образцы (листья) для анализа были собраны в фазе начала цветения (примерно 30–40% открытых цветков) в селение Амсар Кубинского района Азербайджана (12 мая 2019 г). Воздушно-сухие листья (500 г), измельченные в соответствии с требованиями ГФ XI, экстрагировали 70% этанолом 3 раза по 60 мин. при температуре 55–65 °С соотношение «сырье – растворитель» составляло 1:10 [12].

Экстракты отфильтровали, упаривали под вакуумом (ROVA-N2L) до водного остатка, оставляли при +4 °С в холодильнике трое суток.

Выпавший осадок отделяли центрифугированием и для удаления липофильных веществ водный остаток обработали гептаном. Очищенное водное извлечение последовательно обрабатывали хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Полученные извлечения сушили с помощью безводного сульфата натрия и освобождали от растворителя (под вакуумом). Этилацетатные и бутанольные остатки объединяли и растворяли в метаноле и осаждали «сухим» хлороформом (соотношение 1:5). Выпавших осадок желтого цвета отфильтровали на стеклянном фильтре №3 и высушивали в эксикаторе над H 2 SO 4 .

Качественный состав суммы флавоноидов установили методом хроматографии на бумаге Filtrak (FN-16) в следующих системах: I-н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), II-уксусная кислота-вода (15:85), III-н-бутанол-этилацетат-вода (2:9:2), IV-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (10:2:3), V- н-бутанол-пиридин-вода (4:2:2) и хлороформ-уксусная кислота (3:2). Хроматограммы просматривали в видимом и УФ-цвете до и после проявления парами аммиака, 5% спиртовым раствором хлорида алюминия, 1%-ным раствором хлорида железа [13], сахара проявляли анилинфталатом. Индивидуальные флавоноиды выделили путем колоночной хроматографии с полиамидным «Wolem» сорбентом. Элюицию индивидуальных флавоноидов проводили водой и этанолом с повышением концентрации последнего. Процесс элюирования контролировали хроматографией на бумаге в системах I и II. Одинаковые фракции объединяли, освобождали от растворителя и перекристаллизовали из метанола или этанола.

Конфигурацию гликозидных связей, величину окисных циклов углеводной части и строение флавоноидов установили по результатам полных, частичных, ферментативных гидролизов, щелочных деструкций и по данным УФ-спектров с добавлением ионизирующих и комплексообразующих реактивов и сравнением их с литературными данными и данными свидетелей. Гидролиз флавоноидных гликозидов проводили с помощью 1–5% H 2 SO 4 и 5% HCl. Температуру плавления вещества определяли на блоке Кофлера. УФ–спектры выделенных индивидуальных веществ сняты на спектрофотометре “Specol 1500” в кювете с толщиной 10 мм. В качестве растворителя использовали метанол и 95% этанол. Щелочное плавление проводили с кристаллическим свежеплавленным едким калием.

При сравнении хроматографических подвижностей пятен из выделенных соединений были обнаружены кверцетин, кемпферол, изорамнетин, рутин, изорамнетин-3-глюкозид.

Результаты и их обсуждение

В результате двумерной хроматографии на бумаге в системах I и II в первичном экстракте обнаружено наличие 9 соединений фенольной природы, из них 7 веществ дают характерную реакцию на флавоноиды. По величине и плотности пятна вещества 2, 3, 4, 6, 7 являются основными, а вещества 1 и 5 — незначительными. Качественным составом отличаются также суммы извлекаемые хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Основная часть компонентов сосредоточена в фракции этилацетата и н-бутанола.

Из этилацетат-бутанольного извлечения при хроматографии на колонке с полиамидным сорбентом выделили 5 индивидуальных веществ, которые после трехкратной кристаллизации при хроматографировании на бумаге в различных системах дали неизменные пятна, что свидетельствует об их индивидуальности. Выделенные вещества условно обозначены как A, B, C, D и E. На основании пробы по Брианту вещества A, B, C были отнесены к агликонам, а вещества D и E к гликозидам.

Вещество А — желтые кристаллы, легко растворяются в этаноле, метаноле, ацетоне, слабо в эфире не растворимы в гексане, хлороформе и воде, с т. пл. 310–312 °С. УФ спектр λ мах 256, 264, 372 нм в C 2 H 5 OH; CH 3 COONa λ мах 374, 384 нм, CH 3 COONa + H 3 BO 3 λ мах. 259, 390 нм., AlCl 3 λ мах 252, 458 нм., AlCl 3 +НCl λ мах 271,430 нм, C 2 H 5 Ona λ мах 273, 333 нм.

Наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения с CH 3 COONa указывает на наличие свободной окси группы при С 7 , и при добавлении раствора H 3 BO 3 указывает на наличие свободной орто-диоксигруппы при С 3 ′ и С 4 ′ в боковом фенильном радикале. Батохромный сдвиг при AlCl 3 и незначительное изменение при добавлении HCl указывают на свободные окси группы в С 3 и С 5 положениях. При щелочном плавлении образуются флороглюцин и протокатеховая кислота. На основании полученных данных и данных литературы вещество А идентифицировано как 3, 5, 7, 3', 4' — пентаоксифлавон (кверцетин).

Вещество В — желтый порошок с т. пл. 273–275 °С легко растворяется в этаноле, метаноле, ацетоне, слабо в эфире. УФ спектр в C 2 H 3 OH λ мах 267, 368 нм, CH 3 COONa λ мах 273, 380 нм, CH 3 COONa + H 3 BO 3 λ мах , 267, 365, AlCl 3 λ мах 274, 425 нм, AlCl 3 +НCl λ мах 273, 425нм, C 2 H 5 ONa λ мах 276, 408 нм. Сдвиги, которые проявляются при добавлении комплексообразующих и ионизирующих реагентов, указывают, что свободные гидроксильные группы присутствуют в положениях С 3 , С 5, С 7, С 4 ′. При щелочном плавлении образуются флороглюцин и n – оксибензойная кислота. На основании полученных нами данных и данных литературы вещество В идентифицировано как 3,5,7, 4'-тетраоксифлавон (кемпферол).

Вещество С — слегка желтый порошок с т. пл. 306–307 °С (CH 3 OH). УФ-спектр в C 2 H 5 OH λ мах 254, 265, 371 нм, CH 3 СOONa λ мах 274, 380 нм, CH 3 СOONa + H 3 BO 3 λ мах , 254, 372, AlCl 3 λ мах 267, 430нм, AlCl 3 +НCl λ мах 267,428 нм, C 2 H 5 OH λ мах 270, 420 нм. Наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения с CH 3 СОONa и изменение с добавлением H 3 BO 3 , комплексообразование с AlCl 3 и сохранение устойчивости при добавлении НCl указывают на свободные окси группы в положениях С 3 , С 5, С 7 и С 4 . При щелочном плавлении образуется флороглюцин и ванилиновая кислота. На основании полученных данных и данных литературы вещество С идентифицировано как 3,5,7,4'-тетраокси-3'-метоксифлавон (изорамнетин).

Вещество D — желтый порошок с т. п. 191–193°С (CH3OH). Хорошо растворяется в воде, этаноле, метоноле, слабо в ацетоне. УФ спектр в C2H5OH λмах 256, 264, 355 нм, CH3СOONa λмах 273, 391 нм, CH3СOONa + H3BO3, λмах 270, 362, AlCl3 λмах 276, 416 нм, AlCl3+НCl λмах 272, 394 нм, C2H5Ona λмах 274, 411 нм. Сдвиги при добавлении ионизирующих и комплексообразующих реагентов указывают на присутствие незамещенных ОН групп, присутствующих в С5, С7, С3 и С4′ положениях. Вещество D давало положительную цианидиновую реакцию, и образующееся розовая окраска не переходила в октанол, что указывает на его гликозидную природу. Этому свидетельствует еще восстановление жидкости Фелинга после кислотного гидролиза. Кислотный гидролиз с 5%-ной серой кислотой дал агликон, который по значениям Rf, окраске пятен на хроматограмме, а также результатам УФ спектров совпадает с веществом А. В сахарной части гидролизата методом хроматографии с аутентичными образцами установлено наличие D–глюкозы и L-рамнозы. Процентное соотношение глюконовой части глюкозида к агликону указывает на биозидную природу сахарного остатка. Этому свидетельствуют еще то, что при ферментативном гидролизе образуются агликон и биозид соответствующие рутинозе, полученный из образца рутина. По результатам физико-химических, хроматографических, спектральных анализов и сравнение их с литературными данными и аутентичными образцами [14], вещество D идентифицировано как 5,7, 3',4' - тетраоксифлавон-3-β-D-рутинозид (рутин).

Вещество E — желтый кристалл с т. п. 170–172 °C (СH 3 , CH 3 OH). Хорошо растворяются в воде, этаноле, метаноле, слабо в ацетоне. УФ спектр в (C 2 H 5 OH) λ мах 253, 351 нм; (CH 3 СOONa) λ мах. 256, 367 нм; (CH 3 COONa + H 3 BO 3 ) λ мах. 254, 365 нм; (AlCl 3 ) λ мах. 275, 405 нм; (AlCl 3 +НCl) λ мах. 268,401нм; (C 2 H 5 ONa) λ мах. 276, 420 нм. Сдвиги, которые проявляются при добавлении ионизирующих и комплексообразующих реагентов указывают, что свободные гидроксильные группы присутствуют в С 5 , С 7 , С 4 ′ положениях. При кислотном гидролизе образуется агликон идентичный с веществом С и сахаром D-глюкоза что также было подтверждено бумажной хроматографией с достоверными образцами свидетелей. На основании полученных данных и сравнение их с данными литературы вещество Е идентифицировано как изорамнетин-3-глюкозид.

На основании полученных нами данных можно заключить, что листья Rhamnus pallasii содержат кверцетин, кемпферол, изорамнетин, рутин (кверцетин-3-рутинозид), изорамнетин-3-глюкозид. Следует отметить, что кверцетин, кемпферол и изорамнетин для этого растения установлены ранее, а рутин и изорамнетин-3-глюкозид впервые установлено нам.

Заключение

Установлено, что спиртовой экстракт из высушенных листьев Rhamnus pallasii содержит 9 веществ фенольной природы, из которых 7 относятся к флавоноидам. Флавоноидный состав листьев показывает, что листья Rhamnus pallasii можно использовать как источник сырья для получения лечебных средств и пищевых добавок.