Фракционирование антигенов листерий и определение их аллергенных свойств

Листериоз – зоонозная инфекционная болезнь, вызываемая бактерией Listeria monocytogenes и характеризующаяся поражением нервной системы, септическими явлениями, абортами и маститами [2, 3, 4]. Листериоз поражает многие виды домашних, диких животных и представляет большую угрозу здоровью людей [5, 8]. Многообразие клинических проявлений листериоза, включая бессимптомное течение и листерионосительство, часто вызывают определенные трудности в его диагностике [9, 10].

Для ретроспективной диагностики листериоза и листерионосительства может быть использован аллергический метод [6]. О возможности диагностики листериоза по кожной аллергической пробе сообщали отдельные исследователи [1, 7, 11]. Однако, отсутствие специфического аллергена и недостаточная разработанность аллергической диагностики сдерживают его использование в медицинской и ветеринарной практике.

С учетом выше изложенного, целью исследований явилось фракционирование антигенов листерий и определение их аллергенных свойств.

Материал и методы исследований. Биомассу листерий штамма «AУФ» Listeria monocytogenes получали на основе агара Хоттингера с добавлением 0,4 % раствора глюкозы. Двухсуточную культуру бактерий с поверхности агаровой питательной среды смывали физиологическим раствором хлористого натрия и дважды отмывали от остатков питательной среды путем центрифугирования при 5000 g в течение 20 минут.

Для экстракции антигенов листерий использовали 0,2 н раствор серной кислоты и термическую обработку при температуре 121 ºС в течении 30 минут. Кроме того, проводили экстрагирование уксусной кислотой и раствором едкого натрия. Затем антигенные фракции осаждали поэтапно в различных изоэлектрических точках (рН 1,3; рН 4,0, рН 7,1), а также после предварительной нейтрализации осаждением уксусной и трихлоруксусной кислотами. Осадки от надосадочной жидкости отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут.

Выделенные фракции лиофилизировали и в последующем оценивали их активность в качестве аллергена при постановке внутрикожной пробы на сенсибилизированных животных. Кроме того, антиген листерий получали экстракцией детер-гентомдодецил-сульфатом натрия (ДДС-Na) из ацетонового порошка биомассы листерий с последующим осаждением этиловым спиртом и отделением осадка центрифугированием при 10000 g в течении 10 минут и очисткой с последующим диализом против дистиллированной воды. Перед использованием полученные препараты растворяли в физиологическом растворе хлористого натрия, содержащего тритон Х-100 для предотвращения адгезии аллергена на поверхности материала (флаконов и шприцов). Полученные препараты стандартизировали по содержанию белка по 200 мкг в 1 мл. Разведенные препараты стерилизовали автоклавированием при 1 атм. в течение 30 минут.

Корпускулярный аллерген готовили из суспензии листерий в концентрации 2 млрд. микробных клеток в 1 мл физиологического раствора хлористого натрия путем автоклавирования при 1 атмосфере в течение 30 минут. При изучении аллергенной активности полученных препаратов их вводили внутрикожно в объеме 0,1 мл с соблюдением правил асептики и антисептики интактным и сенсибилизированным морским свинкам. Для сенсибилизации морских свинок заражали сублетальной дозой вирулентного штамма листерий или вакцинировали штаммом «АУФ». Результаты аллергической пробы оценивали через 3, 6, 12, 24 и 48 часов. При этом учитывали появление местной воспалительной реакции в виде гиперемии, отека и утолщения кожной складки. Диаметр местной воспалительной реакции и толщину кожной складки измеряли кутиметром до введения аллергена и через разные промежутки после него.

Результаты исследований. После внутрикожной инъекции животным изучаемых препаратов появилась припухлость в виде «лимонной корочки» размером 1-1,5 мм, которая исчезала через 2-3 часа. По истечении 16-18 часов у животных, сенсибилизированных вакцинацией и инъекцией сублетальной дозы вирулентного штамма, появлялась болезненная припухлость и покраснение. Следовательно, после сенсибилизации организма животных листериями развивалась аллергическая реакция по типу гиперчувствительности замедленного типа, которая характерна для инфекционных болезней. После инъекции аллергена местная реакция достигала максимума через 36-48 часов, затем постепенно исчезала, в основном через 72 часа. При положительной реакции диаметр местной воспалительной реакции составил 15-20 мм, толщина кожной складки увеличивалась в 2,5-2,8 и более раз. У интактных животных на месте введения аллергенов воспалительный процесс не проявлялся.

У сенсибилизированных морских свинок положительная местная кожная реакция была после внутрикожной инъекции всех испытуемых препаратов. На месте введения корпускулярного аллергена к 72 часам развивался некротический процесс. Поэтому в качестве диагностического препарата корпускулярный аллерген не может быть использован.

В дальнейших опытах сравнительное изучение отобранных наиболее активных четырех препаратов проводили на кроликах породы «Белый великан», сенсибилизированных заражением сублетальной дозой вирулентного штамма Т-71. Суспензию агаровой культуры вводили внутримышечно в дозе 100 млн. микробных клеток в 1 мл. Через 2 месяца после заражения на них ставили аллергическую внутрикожную пробу. Испытуемые аллергены вводили в области спины на тщательно выстриженном участке.

Результаты аллергических внутрикожных проб на кроликах приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Аллергенная активность препаратов (n=3)

На месте введения аллергена к 24 часам проявляласьвоспалительная реакция (гиперемия, покраснение, отек, припухлость), диаметр которой у препаратов 1, 2 и 3 составил 10-12 мм, и у 4 препарата – 15-18 мм. Толщина кожной складки увеличилась от 1,8 до 2,2 раза. Местная воспа- лительная реакция достигала максимума к 48 часам и почти полностью угасала через 72 часа. Из полученных данных видно, что наиболее выраженной аллергенной активностью обладает аллерген № 4. Данный препарат при многократных введениях интактным морским свинкам и кроликам не вызывал сенсибилизацию организма и выработку специфических антител к листериям. При внутрикожном введении этого препарата сенсибилизированным листериями морским свинкам и кроликам, аллергическая проба была положительной. Учитывая простоту изготовления, хорошую растворимость аллергена № 4 считаем наиболее целесообразным применение его на практике по сравнению с другими полученными препаратами. Следует отметить высокую специфичность данного аллергена, что подтверждалось отсутствием положительной реакции при постановке внутрикожной пробы у инфицированных сальмонеллами кроликов.

Заключение. Вакцинация и инфицирование животных вирулентным штаммом возбудителя листериоза вызывают развитие гиперчувствительности замедленного типа, которая выявляется внутрикожной аллергической пробой.

Фракции полипептидов, полученные путем экстракции биомассы листерий кислотами и щелочами, обладают аллергенными свойствами. Аллергенная активность их варьирует в зависимости от способа получения. Наиболее реактогенным является корпускулярный аллерген, который вызывает на месте инъекции некроз кожи. На основании сравнительного изучения 9 препаратов был отобран аллерген, который проявляет наиболее выраженную аллергенную активность и не вызывает при повторных инъекциях сенсибилизацию организма животных и выработку специфических антител. Данный аллерген является высоко специфичным и позволяет эффективно выявлять животных, сенсибилизированных листериями спустя 2 месяца (срок исследования). Таким образом, инфицирование животных листериями сопровождается аллергической перестройкой организма по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа. Полученный листериозный аллерген является высоко специфичным и обеспечивает выявление животных, контаминированных возбудителем листериоза.

Резюме

Путем фракционирования биомассы листерий кислотами, щелочами и детергентами были получены фракции полипептидов и изучены их аллергенные свойства. Полученные препараты испытали на морских свинках и кроликах. Животных перед постановкой внутрикожной пробы предварительно сенсибилизировали вакцинацией вакцинным штаммом «АУФ» или заражением сублетальной дозой вирулентного штамма возбудителя листериоза. Из 9 испытуемых препаратов наиболее активным оказался аллерген, полученный по методу № 4. Установлено, что вакцинация и заражение морских свинок и кроликов сублетальной дозой вирулентного штамма листерий сопровождается выработкой реакции гиперчувствительности замедленного типа, выявляемой внутрикожной аллергической пробой со специфическим листериозным аллергеном. Аллергенная активность препаратов варьирует в зависимости от способа их фракционирования.