Функциональная активность нейтрофилов у морских свинок, иммунизированных конъюгатами на основе антигенов БЦЖ с бетулином и его производными

Введение. Вакцинация Bacillus Calmette-Guerin (БЦЖ) стала крупным достижением в области профилактики туберкулеза у людей в начале прошлого века, но, несмотря на почти столетнее использование вакцины, ее применение на животных ограничено главным образом по причине поствакцинальных реакций, затрудняющих диагностику заболевания [1, 2].

Одной из перспективных концепций, позволяющей конструировать экологически безопасные молекулярные препараты, позитивно воздействующие на систему иммунитета и не осложняющие контроль за туберкулезной инфекцией в стадах, является конъюгация антигенов, выделенных из вакцинного штамма БЦЖ, с иммуностимулирующей матрицей [3, 4].

Сконструированные по указанному принципу специфические иммуномодуляторы, как показали проведенные исследования, требуют дальнейшего совершенствования, одним из наиболее возможных путей которого являются поиск новых средств с адъювантными свойствами и замена стимулирующей матрицы более эффективными. Весьма перспективным объектом в этом плане является бетулин, содержащийся в верхней, белой части коры березы, а также его производные (бетулиновая и бетулоновая кислоты), обладающие разнообразной биологической активностью, в т. ч. адъювантной [5, 6].

Наиболее ранним звеном воспалительного процесса, индуцированного M. bovis , является реакция фагоцитирующих клеток, осуществляемая с помощью двух различных механизмов. Один из них происходит в анаэробных условиях при участии катионных белков, другой – кисло-родзависимый, реализующийся посредством кислородного взрыва, в процессе которого появляются активные формы кислорода (перекись водорода, гипохлорит-анион, образуемый ферментом лизосом нейтрофилов – миелопероксидазой, и др.) [7].

С этой точки зрения представляется перспективным изучение функциональной активности нейтрофилов, вовлеченных в формирование иммунного ответа у морских свинок на введение экспериментальных конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с бетулином и его производными и последующее инфицирование вирулентной культурой M. bovis .

Цель исследования: изучить активность ки-слороднезависимых и кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофилов у животных, инфицированных Mycobacterium bovis , на фоне предварительной сенсибилизации организма конъюгатами на основе антигенов БЦЖ с бетулином и его производными.

Материалы и методы исследования. Антигенные комплексы получали из культуры вакцинного штамма БЦЖ, выращенной на жидкой синтетической среде Сотона, а затем дезинтегрированной ультразвуком на установке УЗДН-1 в течение 30 мин при частоте 22–35 кГц и мощности 60–70 Вт/см². Разрушенную суспензию центрифугировали и в надосадочной жидкости определяли содержание белка, концентрацию которого доводили до 1 мг/мл белка. Для иммунизации применяли конъюгаты, содержащие антигены БЦЖ в комплексе с корпускулярными адъювантами на основе бетулина, а также его производных: бетулиновой и бетулоновой кислот. Испытывали разные концентрации адъювантов: 0,5; 1,0 и 1,5 мг/мл белка.

Для проведения опыта отобрано 55 морских свинок, отрицательно реагирующих на введение ППД-туберкулина для млекопитающих, из которых сформировали 11 групп по 5 животных в каждой группе. Особям I–III группы подкожно ввели конъюгат на основе антигенов БЦЖ с бетулином в дозе 0,5 мл с содержанием адьюван-та соответственно 0,5; 1,0 и 1,5 мг/мл белка; IV– VI группы – инъецировали подкожно препарат, содержащий антигены БЦЖ в комплексе с бетулиновой кислотой, по идентичной схеме; VII–IX группы – препарат на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в тех же концентрациях; морским свинкам X группы – внутрикожно вакцину БЦЖ в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора. Еще пять интактных особей (группа XI) служили контролем. На 30-е сут по- сле сенсибилизации противотуберкулезными препаратами морские свинки всех групп были инфицированы вирулентной культурой М. bovis (штамм 14), подкожно в дозе 0,001 мг/мл, затем через 45 сут после экспериментального заражения были подвергнуты диагностическому убою для патолого-анатомических исследований. Оценивали показатель пораженности органов по методу С.И. Гельберг, Е.А. Финкель [8].

Отбор проб крови для оценки функционального состояния нейтрофилов, а также аллергические исследования ППД-туберкулином производили на 30-е сут после введения препаратов, а также на 30-е сут после экспериментального инфицирования.

Состояние кислородзависимого метаболизма нейтрофилов оценивали цитохимическим определением активности миелопероксидазы (МПО) по методу Грэхем-Кнолля с использованием бензидина [9]; кислороднезависимого – лизосомально-катионных белков (ЛКБ) по методу М.Г. Шубича с бромфеноловым синим [10]. При анализе мазков подсчитывали процент положительно прореагировавших клеток и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Цифровой материал был подвергнут математической обработке с помощью программы MS Exel 2007 с определением средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (m±). Статистическую существенность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение. Анализ параметров функционального состояния нейтрофилов на 30-е сут после введения экспериментальных конъюгатов показал, что с увеличением в препарате концентрации всех изучаемых нами корпускулярных адъювантов происходит ослабление деятельности антибактериальных систем (табл. 1). Подобная траектория показателей также была характерна для морских свинок, привитых БЦЖ. Так, введение живой вакцины сопровождалось снижением активности неферментных и особенно ферментных систем нейтрофилов, о чем свидетельствовало достоверное уменьшение содержания миелопероксидазы до 0,45±0,06 против 0,84±0,05 (р < 0,01) в контрольной группе.

Таблица 1

Содержание лизосомальных катионных белков и активность миелопероксидазы у морских свинок на 30-е сут после введения противотуберкулезных препаратов, M±m

Номер группы, препарат	Доза, мг/мл белка	ЛКБ	МПО
I (антигены БЦЖ, бетулин)	0,5	1,46*±0,16	1,15±0,16
II (антигены БЦЖ, бетулин)	1,0	1,42±0,25	1,08±0,17
III (антигены БЦЖ, бетулин)	1,5	0,52±0,05*	0,55±0,17
IV (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	0,5	1,08±0,13	1,04±0,14
V (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	1,0	0,68±0,11	0,57±0,06*
VI (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	1,5	0,62±0,11	0,52±0,02**
VII (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	0,5	1,10±0,13	0,99±0,15
VIII (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	1,0	0,77±0,07	0,55±0,10
IX (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	1,5	0,72±0,07	0,59±0,17
X (вакцина БЦЖ)	–	0,70±0,09	0,45±0,06**
XI (контроль)	–	0,92±0,06	0,84±0,05

*р < 0,05; **р < 0,01.

Изменения, свойственные особям, вакцинированным БЦЖ, были отмечены и у морских свинок III, V и VI групп, но с той разницей, что в III группе было зафиксировано наиболее выраженное снижение количества лизосомальных катионных белков (0,52±0,05, 0,92±0,06; р < 0,05), тогда как в V и VI группах – миелопероксидазы соответственно до 0,57±0,06 (р < 0,05) и 0,52±0,02 (р < 0,01) против 0,84±0,05 в контроле. Необходимо отметить, что введение конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в дозе от 1,0 мг/мл белка и выше также способствовало ослаблению функциональной активности бактерицидных систем нейтрофилов, однако не достигало статистически достоверной разницы.

При введении экспериментальных конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с бетулином в дозе 0,5–1,0 мг/мл белка, а также с его производными (бетулиновая и бетулоновая кислота) в дозе 0,5 мг/мл белка, напротив, отмечалась тенденция к усилению активности неферментных и ферментных систем нейтрофилов.

Необходимо отметить, что аллергическая реакция на введение ППД-туберкулина на 30-е сут после обработки противотуберкулезными препаратами развивалась только у морских свинок, привитых вакциной БЦЖ.

На 30-е сут после введения вирулентной культуры микобактерий у морских свинок всех опытных групп выявлены однонаправленные изменения, характеризующиеся усилением антибактериальной активности нейтрофилов относительно контроля (табл. 2).

Таблица 2

Номер группы, препарат	Доза, мг/мл белка	ЛКБ	МПО
1	2	3	4
I (антигены БЦЖ, бетулин)	0,5	1,12±0,03***	0,84±0,11
II (антигены БЦЖ, бетулин)	1,0	1,00±0,11**	0,74±0,13
III (антигены БЦЖ, бетулин)	1,5	0,95±0,09**	0,73±0,10
IV (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	0,5	0,91±0,13*	0,69±0,14

Окончание табл. 2

1	2	3	4
V (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	1,0	0,87±0,07**	0,78±0,03**
VI (антигены БЦЖ, бетулиновая кислота)	1,5	0,78±0,08**	0,68±0,10
VII (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	0,5	1,03±0,04***	0,86±0,04**
VIII (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	1,0	0,94±0,03***	0,73±0,05
IX (антигены БЦЖ, бетулоновая кислота)	1,5	0,90±0,08**	0,72±0,12
X (вакцина БЦЖ)	–	1,45±0,05***	1,12±0,09**
XI (контроль)	–	0,33±0,03	0,61±0,02

*р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001.

Содержание лизосомальных катионных белков

и активность миелопероксидазы у морских свинок на 30-е сут после введения вирулентной культуры M. bovis, M±m

Выраженная активизация как неферментных, так и ферментных систем отмечена только в V, VII и X группах. Так, у животных, привитых БЦЖ, зафиксировано увеличение содержания ЛКБ и активности МПО соответственно в 4,4 (р < 0,001) и 1,83 (р < 0,01) раза; у сенсибилизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в дозе 0,5 мг/мл – в 3,1 (р < 0,001) и 1,4 (р < 0,01) раза; у иммунизированных антигенным комплексом с бетулиновой кислотой в дозе 1,0 мг/мл – в 2,6 и 1,28 (р < 0,01) раза.

В остальных группах введение экспериментальных конъюгатов индуцировало достоверный рост активности кислороднезависимой бактерицидной системы (ЛКБ), тогда как повышение количества МПО, характеризующей кисло-родзависимый метаболизм нейтрофилов, не достигало достоверной разницы.

По результатам патолого-анатомических исследований установлено, что у морских свинок из групп с наиболее высокой активностью бактерицидных систем выявлена самая низкая степень пораженности органов. Так, среднегрупповые значения этого показателя у животных X группы составили 1,60±0,6 баллов, VII группы – 1,80±0,20 и V группы – 2,40±0,40 баллов, тогда как в контрольной группе – 6,60±0,40 балла.

Самая низкая способность противостоять экспериментальному заражению отмечена у особей, которым были введены препараты, содержащие наиболее высокие концентрации корпускулярных адъювантов.

Выводы. Конъюгаты на основе антигенов БЦЖ с бетулином в дозе 0,5–1,0 мг/мл, с бетулиновой и бетулоновой кислотах в дозах 0,5 мг/мл оказывают стимулирующее влияние на активность неферментных (катионные белки) и ферментных (миелопероксидаза) бактерицидных систем нейтрофилов. Увеличение концен- трации корпускулярных адъювантов в препарате приводит к снижению деятельности указанных антибактериальных механизмов.

Введение вирулентной культуры микобактерий (шт. 14) морским свинкам, привитым БЦЖ, а также особям, сенсибилизированным конъюгатами на основе антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой в дозе 1,0 мг/мл и с бетулоновой кислотой в дозе 0,5 мг/мл, сопровождалось достоверным усилением как кислороднезависимой, так и кислородзависимой бактерицидных систем. По результатам патолого-анатомических исследований установлено, что эти препараты к тому же обеспечивали наиболее эффективную защиту животных.

Полученные результаты указывают на перспективность использования производных бетулина в качестве адъювантов иммунобиологических препаратов и необходимость дальнейшего изучения их свойств.