Функциональная активность тромбоцитарного гемостаза у молодняка крупного рогатого скота ярославской породы в ходе фазы растительного питания

Кеуwords: calves, platelets, aggregation, secretion, phase of vegetable nutrition, Yaroslavl breed

Начальные этапы реализации гемостаза весьма важны в сохранении оптимума параметров внутрисосудистой среды во всем организме. Центральное место в первичном гемостазе занимают тромбоциты, значимые для реализации процессов микроциркуляции во всех тканях [4, 7]. Их функциональные возможности важны в обеспечении жидкостных свойств крови в капиллярах [1]. Вместе с тем отмечено, что с возрастом на фоне действия многих средовых факторов гемостатические параметры тромбоцитов способны меняться в разных направлениях [11, 15].

Установлено, что текущий функциональный статус тромбоцитов способен воздействовать на основные физиологические параметры организма, тормозя или ускоряя развитие любой патологии.

Общепризнанное наличие межпородных различий по различным параметрам у крупного рогатого скота позволяет всерьез подозревать существование межпородных отличий в отношении функциональных проявлений тромбоцитов, весьма значимых для обеспечения уровня трофики во всех органах коров и телят разных пород [8]. При этом, возрастные изменения тромбоцитов у крупного рогатого скота, относящегося к разным породам, изучены слабо. Доступны результаты немногих исследований, посвященных изучению параметров тромбоцитов этих продуктивных животных при известной их породной принадлежности [3]. На основе скудной информации, имеющейся в распоряжении, пока невозможно выстроить ясную онтогенетическую динамику гемостатических возможностей тромбоцитов у телят и коров [5]. Для накопления научных сведений в этой области остро требуются дополнительные исследования по разным аспектам физиологии кровяных пластинок у телят и коров разного возраста. Эти наблюдения должны помочь продолжить искать связь между существующим уровнем активности тромбоцитов и выраженностью продуктивных качеств животных на разных этапах их индивидуального развития [12]. Можно думать, что выявление данных различий способно помочь установить моменты, обеспечивающие межпородные различия по объему удоев. По этой причине весьма важно дальнейшее выяснение уровней активности тромбоцитов у молодняка высокомолочных пород в ходе раннего онтогенеза.

Цель – установить уровень функциональной активности тромбоцитов у телят ярославской породы на протяжении фазы растительного питания.

Материал и методы исследований. Работа осуществлена в контексте всех этических норм, очерченных членами Европейского комитета по защите позвоночных животных, участвующих в проведении экспериментов (приняты в Страсбурге 18 марта 1986 года и подтвержденные в Страсбурге 15 июня 2006 года). Исследование было утверждено локальным этическим комитетом, созданным и работающим при Всероссийском НИИ физиологии, биохимии и питания животных – филиале ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста (протокол заседания комитета №4 от 04 апреля 2017 года).

Данная статья подготовлена на материалах наблюдения за 47 телятами, чистокровными по ярославской породе. Их получили после 2 или 3 стельности от здоровых коров. Животные были подвергнуты обследованию четыре раза: на 90 сутки, в возрасте 6 месяцев, в возрасте 9 месяцев и в возрасте 12 месяцев их онтогенеза.

Выявление тромбоцитарной способности к синтезу тромбоксана и синтетические способности циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы кровяных пластинок велось с применением стандартных трех проб переноса с применением фотоэлектроколориметра [2]. В составе тромбоцитов оценивали количественные уровни неметаболических аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата. Определяли возможности тромбоцитов к осуществлению их секреции при стимуляции тромбоцитов коллагеном. В кровяных пластинках отслеживали содержание актина и миозина в неактивном состоянии и в условиях активации путем внесения в плазму с тромбоцитами стандартной дозы аденозиндифосфата [2].

Интенсивность агрегации тромбоцитов (АТ) определяли с помощью визуального микрометода, регистрируя время развития данного явления [13]. В качестве индукторов, вызывающих развитие тромбоцитарной агрегации в ходе работы применили аденозиндифосфат (0,5 х 10-4 М), адреналин (5,0x10-6 М), коллаген (разведение 1:2 основной суспензии), тромбин (0,125 ед/мл) и ристомицин (0,8 мг/мл). Регистрация агрегации кровяных пластинок осуществлялась в плазме, подвергнутой строгой стандартизации по количественному уровню содержащихся в ней тромбоцитов до значения 200x109 тромбоцитов на один литр. Выраженность интраваскулярной агрегации тромбоцитов устанавливали, применяя стандартную фазово-контрастную микроскопию [13].

Обработка статистическими методами полученных в работе данных велась с применением комплекса программ "статистика для Windows v. 6.0, Microsoft Excel. Отличия между сравниваемыми показателями рассматривались как достоверные в случае Р<0,05.

Результат исследований. Уровень в крови телят тромбоцитов-дискоцитов на протяжении фазы растительного питания постепенно понижался, составляя к 12 месяцам жизни величину 64,5±0,20 %. Общее содержание активных разновидностей тромбоцитов у телят в ходе всего наблюдения повышалось на 17,2 %. Количество перемещающихся по их крови мелких и крупных агрегатов тромбоцитов за время наблюдения увеличилось на 11,7 % и 28,6 %, соответственно (Таблица 1).

У молодняка ярославской породы на протяжении фазы растительного питания имело место усиление агрегации тромбоцитов. В течение этой фазы раннего онтогенеза у телят ускорялось развитие АТ с индуктором коллагеном на 12,0 %. У обследованного молодняка найдено ускорение наступления АТ в ответ на аденозиндифосфат на 13,8 % и на ристомицин на 10,8 %. У животных также отмечено ускорение АТ в ответ на индукторы тромбин и адреналин, соответственно на 8,9 % и на 8,2 % (Таблица 2).

У наблюдаемых телят отмечено постепенное усиление генерации тромбоцитарного тромбоксана. Об этом давало возможность говорить увеличение на 14,3 % показателя простой пробы переноса. Это было возможно за счет происходившей в их тромбоцитах активации за последнюю фазу раннего отногенеза тромбоцитарных ферментов циклооксигеназы на 10,9 % и тромбоксансинтетазы на 13,3 %, на что указывало нарастание АТ в двух пробах переноса - коллаген-аспириновой до уровня 88,8±0,15 % и коллагенимидазольной до уровня 55,2±0,19 % (Таблица 3).

Таблица 1 – Активность тромбоцитов в крови телят ярославской породы в ходе фазы растительного питания

Учитываемый показатель	Возраст обследования, n=47, M±m
	91 сутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Уровень тромбоцитов-дискоцитов, %	69,7±0,14	68,5±0,22	66,7±0,19	64,5±0,20
Сумма активированных форм тромбоцитов, %	30,3±0,17	31,5±0,16	33,3±0,15 Р<0,05	35,5±0,18 Р<0,05
Количество малых тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	6,0±0,09	6,3±0,16	6,5±0,13	6,7±0,13 Р<0,05
Количество средних и больших тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	0,21±0,017	0,22±0,020	0,27±0,017 Р<0,05	0,28±0,015 Р<0,01

Примечание: Р – достоверность возрастных изменений показателей по сравнению с уровнем при 91 суточном возрасте. В остальных таблицах обозначения аналогичные

Таблица 2 – Тромбоцитарная способность к агрегации у телят ярославской породы в ходе фазы растительного питания

Учитываемый показатель	Возраст обследования, n=47, M±m
	91 сутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Время развития AТ с АДФ, с	33,0±0,08	32,2±0,26	30,5±0,22 Р<0,05	29,0±0,18 Р<0,05
Время развития AТ с коллагеном, с	28,0±0,17	27,3±0,22	26,6±0,18	25,0±0,15 Р<0,05
Время развития AТ с тромбином, с	46,1±0,12	45,2±0,21	44,0±0,16	42,3±0,20 Р<0,05
Время развития AТ с ристомицином, с	44,1±0,14	43,0±0,22	41,5±0,26	39,8±0,22 Р<0,05
Время развития AТ с адреналином, с	86,7±0,20	84,0±0,31	82,3±0,26	80,1±0,22 Р<0,05

В ходе фазы растительного питания в тромбоцитах телят ярославской породы происходило увеличение содержания аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата на 6,6 % и на 9,5 %, соответственно. В течение наблюдения у животных также отмечено усиление секреторного выброса этих соединений из плотных гранул тромбоцитов на 19,7 и 12,9 %, соответственно.

Количество белков актина и миозина в дискоидных тромбоцитах молодняка в ходе наблюдения испытывало увеличение на 15,4 % и на 18,3 %, достигая уровня 42,6±0,12 % и 21,3±0,18 % общего белка в тромбоците. При этом у наблюдаемых телят в течение фазы растительного питания в тромбоцитах в условиях их агрегации происходило нарастание самосборки актина на 15,5 % и миозина на 14,3 % (Таблица 3).

Собранные физиологической наукой данные позволяют считать, что оптимум параметров крови очень важен для поддержания гомеостаза у млекопитающих в течение всего онтогенеза. Исследователями признается, что многие из них можно рассматривать в качестве надежных маркеров текущего функционального статуса всего организма [9]. Они также очень важны при определении состояния отдельных органов любых млекопитающих. При этом весьма выраженный интерес у многих исследователей вызывает регистрация возрастных изменений в организме животных и в том числе тромбоцитарных характеристик, особенно у представителей высокопродуктивных пород крупного рогатого скота [6].

Таблица 3 – Интратромбоцитарные параметры у телят ярославской породы на протяжении фазы растительного питания

Учитываемый показатель	Возраст обследования, n=47, M±m
	91 сутки	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
Количество АТФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109 тр.	5,94±0,012	6,12±0,025	6,25±0,013	6,33±0,019
Количество АДФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109тр.	3,80±0,010	3,92±0,020	4,07±0,014	4,16±0,013 Р<0,05
Выраженность секреции АТФ,%	39,4±0,15	40,9±0,37	42,7±0,22	44,8±0,21 Р<0,05
Выраженность секреции АДФ,%	49,3±0,05	50,3±0,16	52,6±0,18	55,7±0,10 Р<0,05
Уровень восстановления АТ при проведении коллаген-аспириновой пробы, %	80,1±0,07	82,2±0,22	85,4±0,16	88,8±0,15 Р<0,05
Уровень восстановления АТ при проведении коллаген-имидазольной пробы, %	48,7±0,14	51,8±0,20	53,7±0,12 Р<0,05	55,2±0,19 Р<0,05
Уровень АТ в простой пробе переноса, %	37,8±0,16	39,1±0,23	42,2±0,17 Р<0,05	43,2±0,11 Р<0,05
Количество актина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	36,9±0,12	37,8±0,16	39,3±0,11	42,6±0,12 Р<0,05
Количество актина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	45,7±0,20	47,0±0,18	49,1±0,12	52,8±0,17 Р<0,05
Количество миозина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	18,0±0,18	19,1±0,24	19,9±0,25 Р<0,05	21,3±0,18 Р<0,01
Количество миозина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	35,7±0,10	36,9±0,20	38,6±0,15	40,8±0,13 Р<0,05

Приходит понимание того, что активность тромбоцитов может быть связана с уровнем метаболизма в тканях в любом возрасте, а, следовательно, с выраженностью продуктивных характеристик. При этом рациональные значения тромбоцитарных функций могут создавать условия для стабильно высокой выраженности хозяйственно полезных качеств крупного рогатого скота [12]. Подробное изучение тромбоцитарных функций у телят молочных пород, видимо, может помочь выяснить не только ее динамику в течение отногенеза животных, но и даст основания связать ее с возрастными изменениями различных физиологических характеристик в течение всей жизни. Имевшиеся пробелы в системе общей картины физиологических сведений побудили к выполнению настоящего исследования на молодняке ярославской породы, обладающей высокой молочной продуктивностью [6].

В ходе оценки динамики АТ, стимулированной коллагеном и ристомицином у молодняка ярославской породы удалось констатировать усиление явлений тромбоцитарной адгезии. Есть основания считать, что ее усиление наступало как минимум по двум путям [1]. Нарастание тромбоцитарного ответа на поступление в окружающую тромбоциты плазму коллагена у телят ярославской породы в ходе фазы растительного питания было во многом обусловлено увеличением на тромбоцитах плотности распределения гликопротеидов Iа–IIа и VI, способных с ним соединяться. Еще одним важным механизмом усиления адгезии тромбоцитов у обследованного в ходе фазы растительного питания молодняка можно также рассматривать постепенное нарастание на их мембранах числа гликопротеидных молекул Ib, служащих рецепторами в отношении молекулы фактора Виллебранда [14]. Данное явление, без сомнения, сопровождался нарастанием в крови этих животных концентрации данного вещества. Это предположение подтверждалось зарегистрированным у наблюдаемого молодняка ускорением АТ в ответ на ристомицин.

Установленное у молодняка растительного питания ускорение агрегации тромбоцитов создавало необходимые условия для защиты организма от развития кровопотери. Данный эффект, очевидно, обеспечивался в результате перестройки целого ряда регуляторных систем. Сокращение длительности АТ в последнюю фазу раннего онтогенеза у телят ярославской породы АТ под влиянием сильных стимуляторов этого процесса (коллагена и тромбина) в значительной мере было вызвано ростом плотности на мембранах тромбоцитов телят молекул рецепторов, способных с ними взаимодействовать. Это происходило в результате постепенной активизации фермента фосфолипазы С и всех компонентов фосфоинозитольного пути и увеличения выраженности фосфолирирования протеинов, составляющих в тромбоцитах сократительную систему. Это, без сомнения, должно было сопровождаться у этих телят в конце раннего онтогенеза усилением синтеза в тромбоцитах инозитолтрифосфата, способствующего нарастанию поступления в их цитоплазму ионов Са2+ из состава тромбоцитарных плотных гранул [13].

Зарегистрированная у наблюдаемого молодняка сходная динамика АТ в ответ на применение слабых стимуляторов агрегации в качестве которых выступали аденозиндифосфат и адреналин помогла выяснить динамику основных его механизмов. Возникающие у взятого в опыт молодняка ускорение с возрастом развития АТ в ответ на эти агонисты может считаться результатом постепенного увеличения на его тромбоцитах количества рецепторов к ним при одновременном усилении степени экспрессии молекул фибриногеновых рецепторов (GPIIb-IIIа). Есть основание считать, что попутно с этим у них происходил рост активности тромбоцитарной фосфолипазы А2, приводящий к усилению выделения из фосфолипидных структур мембран порций арахидоната, что являлось серьезной основой активации генерации тромбоцитарного тромбоксана А2 [10]. Также весьма значимым механизмом усиления его генерации надо также считать найденное в ходе постановки проб переноса нарастание у животных уровня активности тромбоцитарных ферментов циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. Также существенным для развития ускорения АТ у животных в ответ на слабые индукторы может быть повышение интенсивности в тромбоцитах явлений актинообразования и миозинообразования, при одновременном усилении секреторных процессов из тромбоцитарных гранул с увеличением    выброса    из    них аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата [2, 4].

Постепенное усиление активизации начальных моментов участия тромбоцитов в процессах гемостаза у молодняка ярославской породы в конце его раннего онтогенеза доказывалось результатами проведенной микроскопической оценки выраженности        внутрисосудистого агрегатообразования кровяных пластинок. Выясненное у молодняка нарастание уровня    активированных    кровяных пластинок говорило об усилении у них степени чувствительности тромбоцитов к физиологическим стимулам. Найденные изменения говорили о развитии у телят в конце раннего онтогенеза снижения целостности сосудистого эндотелия. Также это указывало на некоторое увеличение в крови телят ярославской породы, способных к растворению индукторов агрегации кровяных пластинок. Видимо это сопровождалось ростом уровня экспрессии в кровь субэндотелиального коллагена,    способного    выраженно активировать тромбоциты. Без сомнения, эти процессы в значительной мере приводили к постепенному росту уровня свободно перемещающихся по крови агрегатов тромбоцитов любого размера [13].

Зарегистрированное      усиление выраженности активности тромбоцитов у наблюдавшегося             молодняка, потребляющего только растительные корма, способствовало созданию условий в его организме для минимизации риска наступления       кровотечений       и физиологически невыгодных изменений гемодинамических     процессов     в микрососудах всех органов. Выявленные изменения сохраняли в границах физиологического             оптимума тромбоцитарно-сосудистые взаимодействия. Выявленное постепенное повышение внутрисосудистой агрегации тромбоцитов у обследованных животных ярославской породы помогает сохранять в ходе фазы растительного питания оптимум деятельности компонентов первичного гемостаза при сбалансированности в нем явлений протромботического и антитромботического характера. Уравновешенность их активности у телят, относящихся к ярославской породе, на протяжении фазы растительного питания формирует у них достаточность на этом этапе их жизни выраженности первичного гемостаза и оптимизирует общую активность тромбоцитов при завершении роста и созревания молодняка.

Заключение. У молодняка ярославской породы на протяжении фазы растительного питания было прослежено некоторое повышение функциональных возможностей находящихся в крови тромбоцитов. Усиление тромбоцитарных функций у этих животных вызвано постепенным повышением интенсивности в них работы механизмов, реализующих тромбоцитарные агрегацию, адгезию и секрецию. Эти изменения у телят ярославской породы, видимо, во многом связаны с полным переходом животных на корма, имеющие строго растительный состав. Найденное увеличение активности тромбоцитов у обследованного молодняка ярославской породы в течение заключительной фазы раннего онтогенеза, очевидно, носит адаптивный характер и регулирует процессы кровотока во всех внутренних органах у подрастающего молодняка.

Резюме

Цель работы – установить уровень функциональной активности тромбоцитов у телят ярославской породы на протяжении фазы растительного питания. Наблюдение проведено на 47 здоровых телятах ярославской породы, полученных в результате 2-3 стельности от коров, являвшихся полностью здоровыми. У молодняка выявлено ускорение развития процесса агрегации тромбоцитов со всеми испытанными агонистами. У наблюдавшихся животных в крови имелась тенденция к сокращению уровня дискоцитов и повышению числа активированных тромбоцитов и их агрегатов. Выявленное усиление функциональных возможностей тромбоцитов наступило у наблюдаемых телят, в том числе за счет роста усиления генерации в них тромбоксана, повышения содержания в их гранулах аденозинфосфатов, активации нарастания в них концентрации актина и миозина с интенсификацией самосборки этих белков в условиях стимуляции кровяных пластинок. Можно считать, что для молодняка ярославской породы на протяжении фазы растительного питания свойственно постепенное усиление функциональных свойств кровяных пластинок, способствующее более полной их адаптации к условиям существования.