Функциональные особенности тромбоцитов у телят голландской породы на протяжении фазы молочно-растительного питания

Разными исследователями признается, что кровь выполняет в организме важную интегративную функцию [8]. Обладая целым рядом регуляторных механизмов, кровь способствует сохранению гомеостаза во всех органах на протяжении всего онтогенеза млекопитающих [3]. Биологически весьма значимое место в числе регуляторных механизмов крови принадлежит системе гомеостаза [12]. Она весьма сложна и включает в себя в числе прочего и тромбоциты. Функциональные особенности этих форменных элементов в значительной мере определяют протекание всего гемостаза и микроциркуляции во внутренних органах [13]. Морфофункциональные показатели тромбоцитов весьма чувствительны к различным воздействиям на организм. Это было отмечено на различных биологических объектах, в том числе на продуктивных животных [15].

В настоящее время установлен ряд моментов функциональной активности тромбоцитов у телят и коров [1, 14]. Признается серьезная практическая значимость выяснения основных моментов функционирования тромбоцитарного гемостаза у молочных пород крупного рогатого скота [5]. Есть мнение, что исследования в данном направлении могут раскрыть связи тромбоцитарной активности и уровня молочной продуктивностью коров. В тоже время собранная информация о породных особенностях активности тромбоцитов у крупного рогатого скота весьма скудна. Принимая во внимание большое значение активности тромбоцитов для деятельности первичного гемостаза и интенсивности капиллярного кровотока, влияющего на анаболизм в тканях становится ясна особая важность их изучения на протяжении всех этапов роста организма продуктивных животных [4,7]. Ввиду наличия целого ряда различий по морфофункциональным параметрам у каждой из пород крупного рогатого скота вызывает серьезный научный интерес дальнейшее изучение различных физиологических характеристик молодняка молочных пород и в том числе голландской породы [9], в том числе параметров тромбоцитов на протяжении фазы молочно-растительного питания.

Цель – установить особенности тромбоцитарной активности у телят голландской породы в течение фазы молочно-растительного питания.

Материал и методы исследований. Исследование, лежащее в основе статьи, проводилось в полном соответствии со всеми этическими вопросами, закрепленными Европейской конвенцией по защите позвоночных, используемых в научных экспериментах (принята в Страсбурге 18 марта 1986 года и подтверждена в Страсбурге 15 июня 2006 года).

Выполненное исследование осуществлено на 41теленке, которые были чистокровны по голландской породе и находились в фазе молочно-растительного питания раннего онтогенеза. Весь молодняк включенный в исследование был получен от полностью здоровых коров в результате второй или третьей стельности, прошедшей без особенностей. Все телята были осмотрены и обследованы за фазу молочного питания 5 раз: на 31 сутки, на 45 сутки, на 60 сутки, на 75 сутки и на 90 сутки их жизни.

У животных принятых на исследование, с помощью стандартного метода с применением пробы переноса, проведена оценка интенсивности генерации тромбоксана в кровяных пластинках. При помощи постановки дополнительных переносных проб с применением фотоэлектроколориметра, была проведена непрямая регистрация уровня активности тромбоцитарных ферментов циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы. В гранулах тромбоцитов телят оценивали содержание аденозинфосфатов: аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ), а также регистрировали уровень их секреции после внесения в плазму аликвоты раствора коллагена. В кровяных пластинках телят выясняли содержание актина и миозина в интактном состоянии и при их активации путем внесения в плазму дозы АДФ [2].

Агрегацию тромбоцитов (АТ) выясняли в ходе проведения стандартного микрометода оценки АТ, применяя в качестве стимуляторов этого процесса АДФ в количестве 0,5 х 10-4 М, коллагена при его разведении 1:2 от основной суспензии, ристомицина в количестве 0,8 мг/мл, тромбина в количестве 0,125 ед/мл, адреналина в количестве 5,0x10-6 М в плазме, богатой по количеству тромбоцитов и подвергнутой строгой стандартизации по их количеству до уровня 200x109 тромбоцитов на 1 литр крови [12]. Выраженность интраваскулярной тромбоцитарной активности, определяли путем микроскопии со стандартным фазовым контрастом [12].

Статистическая обработка полученной информации производилась путем применения основных программ: Статистика для Windows V. 6.0, Microsoft Excel. Различия между сравниваемыми данными считались достоверными в случае Р<0,05.

Результат исследований. В течение фазы молочно-растительного питания, у телят чистокровных по голландской породе крупного рогатого скота отмечено развитие понижения активности тромбоцитов. У обследованных животных наступление агрегации тромбоцитов под влиянием коллагена замедлялась на протяжении третьей фазы раннего онтогенеза на 11,6 % и развиваясь на 90 сутки жизни за 49,0±0,08 с. Сходную направленность процесса АТ нашли у телят для индукторов АДФ и ристомицина. Тромбоцитарная агрегация, индуцированная этими индукторами, замедлялась между 31 и 90 сутками их жизни на 17,7 и на 15,7 %, соответственно. Также найдено торможение АТ под влиянием тромбина на 13,6 % и адреналина на 14,9 % (Таблица 1).

Уровень в крови наблюдавшихся телят неактивных тромбоцитов на протяжении фазы молочно-растительного питания постепенно увеличивался. Это сопровождалось понижением на 46,7 % уровня их активных форм у обследованных животных. Содержание в крови свободно движущихся разного размера агрегатов тромбоцитов у телят голландской породы за третью фазу раннего их онтогенеза, снизилось: мелких их агрегатов на 26,7 %, средних и крупных их агрегатов в 1,5 раза, соответственно (Таблица 1).

У наблюдавшихся телят, между 31

и 90 сутками онтогенеза, отмечено снижение активности образования в тромбоцитах тромбоксана. На это указывало уменьшение у телят показателя простой пробы переноса на 21,5 %, составлявшего на 90 сутки онтогенеза

18,6±0,14 %. Найденный результат базировался у обследованных животных на снижении в их тромбоцитах активности ферментов–циклооксигеназы на 16,4 % и тромбоксансинтетазы на 20,7% (Таблица 2).

Таблица 1 – Агрегационная функция тромбоцитов у телят голландской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Гематологические показатели телят	Телята голландской породы, n=41, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Длительность развития агрегации тромбоцитов с АДФ, с	53,6±0,19	54,8±0,14	57,2±0,16	60,2±0,13 Р<0,05	63,1±0,15 P<0,05
Длительность развития агрегации тромбоцитов с коллагеном, с	42,1±0,12	42,6±0,16	43,1±0,10	45,6±0,16	49,0±0,08 P<0,05
Длительность развития агрегации тромбоцитов с тромбином, с	63,8±0,10	64,2±0,15	65,0±0,12	69,8±0,17 Р<0,05	72,5±0,12 Р<0,05
Длительность развития агрегации тромбоцитов с ристомицином, с	61,5±0,12	61,9±0,16	62,6±0,20	67,3±0,15 Р<0,05	71,2±0,13 Р<0,05
Длительность развития агрегации тромбоцитов с адреналином, с	109,3±0,19	110,3±0,22	112,8±0,16	119,5±0,22	125,6±0,28 Р<0,05
Неактивные тромбоциты, %	86,5±0,27	87,5±0,25	88,5±0,19	90,1±0,26	91,8±0,23
Активные тромбоциты, %	13,5±0,10	12,5±0,08	11,5±0,09 P<0,05	9,9±0,05 P<0,01	9,2±0,04 P<0,01
Содержание малых агрегатов тромбоцитов, на 100 свободных тромбоцитов	1,9±0,04	2,0 ±0,03	1,8±0,02	1,7±0,03 P<0,05	1,5±0,04 P<0,01
Содержание средних и больших агрегатов тромбоцитов, на 100 свободных тромбоцитов	0,03±0,010	0,03±0,013	0,02±0,014 P<0,01	0,02±0,016 P<0,01	0,02±0,014 P<0,01

Примечание: P – достоверность изменения величины показателей по сравнению с 31 суточным возрастом. В последующей таблице обозначения сходные

Невысокое на момент взятия в исследование содержание в кровяных пластинках телят АТФ и АДФ, на протяжении наблюдения уменьшалось на 20,4 % и на 21,2 % соответственно. В течение выполненного наблюдения объем их секреции из тромбоцитарных гранул сократился и к концу проводимого исследования достиг 18,8±0,09 % и 26,7±0,08 %, соответственно. В течение исследования у наблюдавшихся животных в неактивированных тромбоцитах содержание белков актина и миозина снижалось на 18,7 % и на 15,4 %. К концу наблюдения их количество составляло 15,0±0,07 и 6,5±0,14 % к уровню общего белка в тромбоцитах. На протяжении исследования у телят голландской породы выраженность дополнительного образования в тромбоцитах молекул актина и миозина, в условиях агрегации      составило на 15,7  % и на 15,1  %, постепенно ослабевала, что суммарно      соответственно.

Таблица 2 – Показатели механизмов тромбоцитарной активности у телят голландской породы в течение фазы молочно-растительного питания

Гематологические показатели телят	Телята голландской породы, n=41, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Степень восстановления АТ при проведении коллаген-аспириновой пробы, %	70,2±0,16	69,1±0,12	67,5±0,21	63,5±0,17 Р<0,05	60,3±0,14 Р<0,05
Степень восстановления АТ при проведении коллагенимидазольной пробы, %	32,0±0,16	30,4±0,10	29,0±0,13 Р<0,05	27,5±0,09 Р<0,05	26,5±0,12 Р<0,01
Выраженность АТ в простой пробе переноса, %	22,6±0,16	21,8±0,14	21,0±0,20	19,6±0,13 Р<0,05	18,6±0,14 Р<0,01
Содержание АТФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109 тр.	4,96±0,025	4,90±0,018	4,79±0,016	4,35±0,014 Р<0,05	4,12±0,017 Р<0,01
Содержание АДФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109тр.	2,92±0,006	2,86±0,007	2,78±0,005	2,56±0,003 Р<0,05	2,41±0,006 Р<0,01
Выраженность секреции АТФ, %	22,5±0,12	2,17±0,14	20,2±0,08 Р<0,05	19,3±0,05 Р<0,05	18,8±0,09 Р<0,01
Выраженность    секреции АДФ,%	30,1±0,04	28,9±0,10	28,0±0,09	27,1±0,14 Р< 0,05	26,7±0,08 Р<0,05
Содержание актина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	17,8±0,14	17,5±0,10	17,2±0,07	15,9±0,06 Р<0,05	15,0±0,07 Р<0,01
Содержание актина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	28,0±0,16	27,5±0,14	27,7±0,20	25,8±0,14	24,2±0,12 P<0,05
Содержание миозина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	7,5±0,10	7,7±0,08	7,4±0,12	6,9±0,10	6,5±0,14 P<0,05
Содержание миозина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	19,1±0,14	18,7±0,16	18,3±0,07	17,2±0,10 P<0,05	16,6±0,06 P<0,05

Не вызывает сомнений, что кровь – это основная интегрирующая жидкость организма. Весьма важной ее системой является система гомеостаза, которая включает ряд компонентов и в том числе тромбоциты. Их функциональная активность во многом определяет ход гемоциркуляции во внутренних органах и уровень их функционирования [11]. При этом функциональные параметры тромбоцитов весьма чувствительны к воздействиям на организм из внешней среды [4]. Весьма важно продолжение изучения основных аспектов тромбоцитарного гемостаза у молодняка крупного рогатого скота, разных пород по причине возможности прояснения вопросов связи тромбоцитарной активности с продуктивностью животных [6]. В настоящее время выяснены лишь отдельные аспекты активности тромбоцитов у телят. Пока нет достаточной информации о породных особенностях активности тромбоцитов на разных возрастных этапах у крупного рогатого скота.

Учитывая серьезную значимость активности тромбоцитов для реализации капиллярного кровотока, а, следовательно, трофики органов представляют серьезный интерес дополнительные исследования в этом направлении. Для решения данного вопроса наиболее удобным объектом исследования могут являться телята высокоудойных пород крупного рогатого скота, в том числе голландской породы, находящихся в фазе молочнорастительного питания [10].

У телят найдено понижение уровня чувствительности тромбоцитов в ответ на коллаген и ристомицин, являющихся стимуляторами их агрегации. Выявленное у включенных в исследование животных постепенное замедление АТ при добавлении к плазме этих индукторов говорило об ослаблении выраженности адгезивных возможностей их тромбоцитов. Это было связано у телят с развитием уменьшения на мембранах тромбоцитов числа рецепторов, имеющих возможность взаимодействовать с коллагеном – молекул гликопротеидов Iа – IIа и VI [13]. Также большое значение в понижении адгезивных возможностей тромбоцитов телят голландской породы, видимо, имело снижение чувствительности тромбоцитов в отношении ристомицина. Это происходило во многом за счет постепенного уменьшения количества в крови обследованного молодняка фактора Виллебранда и понижения на наружных поверхностях тромбоцитов этих животных количества молекул рецепторов к нему (GPI в).

У молодняка голландской породы на протяжении фазы молочнорастительного питания, также отмечено небольшое ослабление выраженности агрегации тромбоцитов в ответ на остальные испытанные агонисты.

Замедление процесса агрегации тромбоцитов в отношении сильных индукторов агрегационного процесса-коллагена и тромбина, видимо, имело в своей основе на ряду с рецепторными изменениями также уменьшение в тромбоцитах функциональных возможностей фосфолипазы С, ферментов цикла фосфоинозитолов и выраженности фосфолирирования нитей актиномиозинового аппарата [14]. Складывающаяся ситуация в тромбоцитах наблюдаемых животных обеспечивала дополнительное функционально выгодное понижение образования инозитолтрифосфата и снижение входа в тромбоциты Са2+. Это ослабляло у них на протяжении периода наблюдения генерацию молекул актомиозина, а значит степень его участие в реализации секреторных процессов из тромбоцитов.

Применение слабых стимуляторов тромбоцитов-адреналина и АДФ, продемонстрировало на протяжении фазы молочно-растительного питания у телят голландской породы, торможение наступления агрегации. Очевидно эти изменения в своей основе имели постепенное уменьшение количества молекул рецепторов к ним на тромбоцитарной поверхности и понижение числа тромбоцитарных молекул GPIIb-IIIа, способных соединяться с молекулами фибриногена. Кроме того, в тромбоцитах, активированных АДФ и адреналином происходило ослабление функциональных возможностей фосфолипазы А2. Складывающаяся ситуация формировала функциональный минимум выброса из состава фосфолипидов тромбоцитов арахидоновой кислоты, приводя к сокращению количества субстрата для тромбоксанового синтеза [2]. Данному результату также способствовала у телят голландской породы небольшая активность в кровяных пластинках тромбоксансинтетазы и циклооксигеназы, которая подтверждалась результатами проведенных переносных проб. Найденное у телят голландской породы на протяжении третьей фазы раннего онтогенеза ослаблением АТ, под влиянием всех испытанных индукторов также может быть связано с ослаблением в их тромбоцитах процессов миозинообразования и актинообразования и с понижением выраженности секреции из тромбоцитарных гранул аденозинфосфатов [15].

В течение фазы молочнорастительного питания в крови обследованных телят отмечена исходно небольшая склонность тромбоцитов к развитию внутрисосудистой агрегации. Это создавало условия для обеспечения невыраженной внутрисосудистой тромбоцитарной активности, которая в процессе наблюдения несколько понижалась. Наличие в крови голландских телят небольшого количества активных вариантов тромбоцитов являлось дополнительным доказательством их невыраженной чувствительности к различным активирующим влияниям у молодняка этой породы. Кроме того, найденный у них невысокий уровень внутрисосудистой активности тромбоцитов также являлся следствием слабой доступности молекул коллагена, расположенных в субэндотелии сосудистых стенок [3]. Данные обстоятельства обеспечивали у наблюдаемых телят условия для минимизации содержания в их крови активированных тромбоцитов и разного размера тромбоцитарных агрегатов.

Полученные результаты указывали на некоторое снижение в течение третьей фазы раннего онтогенеза чувствительности тромбоцитов телят голландской породы, к постоянно содержащимся в небольшом количество в плазме стимуляторам тромбоцитарной агрегации (АДФ, тромбин, адреналин) [12]. Это дополнительно способствовало уменьшению в крови обследованных животных уровня активных форм кровяных пластинок и циркулирующих по крови тромбоцитарных агрегатов [5].

Выявленное в исследовании некоторое понижение активности тромбоцитов в кровотоке телят голландской породы на протяжении фазы молочно-растительного питания можно рассматривать как важный маркер снижения функциональных возможностей кровяных пластинок in vivo и невысокой активности внутри тромбоцитарных и рецепторных механизмов кровяных пластинок, находящихся в крови животных. Происходящие изменения в тромбоцитах наблюдавшихся телят, без сомнения, позитивно влияют на процессы перемещения крови в капиллярах, что способствует улучшению трофики всех их тканей [14].

Заключение. На протяжении фазы молочно-растительного питания у молодняка голландской породы, отмечается невысокая функциональная активность кровяных пластинок. Складывающаяся ситуация достигается у этих телят на протяжении третьей фазы раннего онтогенеза за счет невыраженной биологической активности механизмов, реализующих основные гемостатические функции тромбоцитов. Невысокая интрасосудистая тромбоцитарная активность обеспечивала у наблюдавшихся телят на протяжении фазы молочно-растительного питания условия для оптимума активности у них первичного гемостаза и процессов микроциркуляции во всех тканях. Складывающаяся ситуация способствовала их успешному росту, развитию и формированию основ высокой будущей молочной продуктивности, свойственной для голландской породы.

Резюме

В течение проведенного наблюдения у телят отмечено постепенное ослабление тромбоцитарной агрегации с увеличением в их крови дискоидных тромбоцитов. В этих условиях у них в крови уменьшалось количество активированных тромбоцитов и содержание разных агрегатов, состоящих из тромбоцитов. Найденные изменения были связаны с происходящим у животных торможением синтеза в кровяных пластинках тромбоксана, снижением количества в тромбоцитарных гранулах адениловых нуклеотидов и ослаблением их секреторного выброса. На протяжении периода наблюдения содержание в тромбоцитах молекул актина и миозина и их самосборка при тромбоцитарной активации было небольшим и в ходе исследования постепенно уменьшались. Уровень активности тромбоцитов у телят голландской породы обеспечивает на протяжении фазы молочно-растительного питания функциональную достаточность первичного гемостаза, требующуюся для оптимального развития молодняка.