Гемокоагуляция и липидпероксидация у женщин, принимающих половые стероиды с этинилэстрадиолом и прогестагеном дроспиреноном

Введение. Во всем мире выявлена четкая тенденция: планирование деторождения постепенно сдвигается к позднему репродуктивному возрасту и это актуализирует проблему сохранения репродуктивного здоровья и предупреждения нежелательной беременности [20]. Среди способов контрацепции все более широкое распространение получают комбинированные оральные контрацептивы (КОК). Их применение в нашей стране слабо контролируется: женщины часто используют КОК без консультации врача (препараты КОК находятся в свободной продаже в аптечной сети), что ставит вопрос о безопасности их широкого использования: применение КОК сопровождается осложнениями, среди которых наиболее опасны тромботические [10, 17, 20, 28]. Известно свойство половых стероидов и их производных ускорять ли-пидпероксидацию (ЛПО) [11, 24], ведущую к ги-перкоагулемии [3–5]. Это привело к углубленному изучению изменений скорости ЛПО под влиянием гестагенов и эстрогенов и их роли в развитии гемостатических нарушений [8, 19].

Цель нашего исследования – изучение характера сдвигов в гемостазе и в процессах ЛПО у женщин, использующих современный, широко распространенный КОК, включающий этинилэст-радиол и дроспиренон – прогестаген четвертого поколения.

Материалы и методы. Обследованы 182 женщины 18–35 лет (28,9 ± 0,3), использующие моно-фазный КОК в течение 21 дня с 7-дневным перерывом. Первая группа принимала КОК (препарат «Ярина», Bayer Schering Pharma AG), содержащий 30 мкг этинилэстрадиола (ЭЭ) и дроспиренон (3 мг). Контрольная группа (n = 91, возраст тот же) не использовала КОК. Кровь исследовали до приема КОК, после 1, 3, 6, и 12-го циклов. Состояние клеток оценивали на автоматическом гематологическом анализаторе МЕК – 6.400 J-К, определяя их численность, тромбоцитарные индексы (средний объем – MPV), тромбокрит (PCT), ширину распределения по объему (PDW). MPV (Mean Platelet Volume) – средний объем тромбоцитов – увеличивается с возрастом: с 8,6–8,9 фл у детей 1–5 лет до 9,5–10,6 фл у людей старше 70 лет. «Молодые» кровяные пластинки более объемны, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза их средний объем возрастает. Напомним, что РСТ (Platelet Crit) – тромбокрит – параметр, отражающий долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами, составляя в норме 0,15–0,40 %, PDW (Platelet Distribution Width) – ширина распределения клеток по объему – измеряется в процентах и количественно отражает гетерогенность популяции тромбоцитов по размерам (степень их анизоцитоза). В норме этот показатель составляет 1–20 %. Нали- чие в крови преимущественно молодых форм приводит к сдвигу гистограммы вправо.

Способность тромбоцитов к агрегации оценивали двуканальным лазерным анализатором АЛАТ2 «Биола», Россия. Как индуктор использовали АДФ (конечная концентрации 5 мкмоль/л по инструкции фирмы). В агрегатограмме определяли: степень агрегации (СА, отн. ед.), время достижения максимального размера агрегатов ( t МРА, с), скорость достижения максимального размера (МРА, отн. ед./мин), время достижения максимальной скорости образования максимальных агрегатов ( t МСМРА, с), степень агрегации (СА, %), время достижения максимальной агрегации ( t МА, с), максимальную скорость агрегации (МСА, %/мин), время ее достижения ( t МСА, с). Фактор (ф.) Р 3 в плазме определяли по разнице АВР плазмы до и после удаления из нее тромбоцитов по Rabiner, Groder.

Коагуляционное звено крови оценивали по описанию, определяя на гемокоагулометре (4-канальный “TROMB-4”, Ольвекс, Россия): активированное время рекальцификации (АВР), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время по Квику в секундах, выражая результат как протромбиновое отношение (ПО) [2, 14], для учета международного индекса чувствительности тромбопластина (МИЧ) возводили величину ПО в степень МИЧ (указана на маркировке), рассчитывая международное нормализованное отношение (МНО). Тромбиновое время (ТВ) оценивали по описанию [2, 14], концентрацию фибриногена (ФГ) – хронометрически по Клауссу [1, 14]. Растворимые комплексы фибринмономеров (РКФМ) определяли количественным вариантом фенантролинового теста. Отмечали время появления паракоагулята в секундах и по таблице определяли количество РКФМ в исследуемой плазме [2, 14]. Активность антитромбина III (АТ III) определяли по описанию, выражая в % [2, 14, 15]. Индекс резерва плазминогена (ИРП) устанавливали по времени лизиса фибрина в активированной стрептокиназой эуглобулиновой фракции плазмы, сравнивали со средним временем лизиса эуглобулинов в контрольных образцах плазмы здоровых людей, рассчитывая ИРП по формуле:

ИРП,% = ЛИСК / ЛИСИ X 100, где ЛИСК – среднее время лизиса эуглобулинов в контроле, ЛИСИ – среднее время лизиса эуглобулинов в исследуемом образце.

Техника определения всех этих показателей соответствовала инструкции фирмы изготовителя реагентов «Технология-Стандарт» [1, 2, 13].

Концентрацию D-димеров определяли на анализаторе “NycoCard ReaderII” (цветная рефлекто-метрия), регистрируя относительную интенсивность цвета (реагенты “NycoCard Reader II D-Dimer” фирмы AXIS-SHIELD PoC AS).

Концентрацию ф. Виллебранда (fW) (Techno- clone vWF: Ag ELISA, кат. № 5450201), гомоцистеина (Axis® Homocysteine EIA, кат. № 414-8880), эндотелина (Biomedica ENDOTELIN(1-21), кат. № BI-20052) определяли по описанию (инструкция фирмы-производителя) методом иммунофер-ментного анализа) на спектрофотометре ImmunoHEM 2100.

Интенсивность ЛПО в эритроцитах устанавливали спектрофотометрически по уровню липидпероксидов в гептановой и изопропанольной фазах экстракта [21]. Анализировали ненасыщенные липиды с изолированными двойными связями (ИДС) при λ 220 нм, диеновые конъюгаты (ДК) полине-насыщенных жирных кислот (первичные продукты ЛПО) при λ 232 нм, сумму сопряженных трие-нов и кетодиенов (СТ + КД) (вторичные продукты ЛПО) при λ 278 нм, шиффовы основания (конечные продукты ЛПО) при λ 440 нм. Это позволило дифференцированно определять эфирно-связанные продукты пероксидации фосфолипидов изопропа-нольной фазы [16] и неэтерифицированных интермедиатов переокисления жирных кислот гептановой фазы [25]. Результат выражали в единицах оптической плотности (ед. опт. пл.). Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли спектрофотометрически [9].

Антиоксидантный потенциал оценивали по активности глутатион-S-трансферазы плазмы крови (спектрофотометрия, в мкмоль/мл/мин) [9], по активности супероксиддисмутазы (СОД, %) [23] и по уровню в плазме витаминов А и Е (мкг/мл), оцениваемому на флуориметре «Квант 9» [22].

Статистическая обработка результатов выполнена на ПЭВМ с использованием стандартных пакетов прикладного анализа (Statistica for Windows v.6.0): вычисляли среднюю арифметическую ( M ), ее ошибку ( m ), среднеквадратическое отклонение (σ). Для оценки достоверности отличий вычисляли коэффициент Манна – Уитни – различия достоверны при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение. Оценивая показатели тромбоцитарного звена гемостаза (табл. 1), уже после 1-го цикла приема КОК увеличилось на 13 % количество тромбоцитов, вернувшись к исходному только после 12-го цикла. Прослеживалась после 1-го цикла и тенденция к росту среднего объема тромбоцитов и ширина их распределения по объему, свидетельствуя о преобладании молодых форм клеток. После 12-го цикла тромбоцитарные индексы уменьшились (признак замедления тромбоцитопоэза).

При оценке функций тромбоцитов (табл. 2) достоверные изменения ( p < 0,05) выявлены уже после 1-го цикла приема КОК, касаясь практически всех показателей агрегатограммы и сохраняясь весь период исследований. Так, время достижения максимального размера агрегатов ( t МРА) стало короче на 41 % после 1-го цикла и на 60 % после 12-го. Увеличилась степень их агрегации (СА)

Проблемы здравоохранения

Таблица 1

Количественные показатели тромбоцитарного звена гемостаза женщин, получавших 30 мг этинилэстрадиола в сочетании 3 мг дроспиренона ( n в группе, получавшей КОК, равно 20)

Показатель	Контроль, n = 91	После 1-го цикла	После 3-го цикла	После 6-го цикла	После 12-го цикла
ТЦ, 109/л	262,36 ± 6,46	297,93 ± 13,36*	287,10 ± 13,03	268,13 ± 15,28	265,00 ± 22,88
PCT, %	0,19 ± 0,01	0,20 ± 0,02	0,20 ± 0,01	0,17 ± 0,01	0,17 ± 0,02
MPV, фл	6,03 ± 0,19	6,01 ± 0,45	6,21 ± 0,37	6,67 ± 0,58	5,35 ± 0,81
PDW, %	16,98 ± 0,12	17,05 ± 0,43	17, 20 ± 0,25	17,03 ± 0,36	16,87 ± 0,19

Примечание. ТЦ – общее количество тромбоцитов; PCT – тромбокрит; MPV – средний объем тромбоцитов; PDW – ширина распределения тромбоцитов по объему; * – величины, достоверно отличающиеся от контроля ( р < 0,05).

Таблица 2 Тромбоцитарное звено гемостаза и эндотелиальные факторы у женщин на фоне приема 30 мкг этинилэстрадиола с 3 мкг дроспиренона

( n в группе, получавшей КОК, равно 20)

Показатель	Контроль, n = 54	После 1-го цикла	После 3-го цикла	После 6-го цикла	После 12-го цикла
СА, отн. ед.	6,49 ± 0,26	4,14 ± 0,86*	5,48 ± 0,48*	6,74 ± 0,36	3,95 ± 0,6*
t МРА, с	23,39 ± 1,53	13,67 ± 1,91*	27,31 ± 4,28	22,01 ± 2,26	9,33 ± 1,67*
МРА, отн. ед. / мин	15,55 ± 1,07	8,29 ± 1,86*	15,79 ± 1,29	17,54 ± 1,21	7,03 ± 2,18*
t МСМРА, с	10,41 ± 0,17	30,67 ± 17,9	13,38 ± 2,22	11,0 ± 0,7	88,6 ± 76,67
СА, %	58,76 ± 1,95	66,94 ± 1,49*	66,50 ± 1,22*	65,77 ± 0,92*	69,77 ± 3,32*
t МА, с	283,42 ± 2,49	273,67 ± 5,91	269,8 ± 16,31	243,93 ± 20,89	222,0 ±70,0
МСА, %/мин	33,63 ± 1,68	50,03 ± 2,78*	41,36 ± 1,55	38,27 ± 2,41	31,27 ± 10,63
t МСА, с	18,69 ± 1,01	31,06 ± 18,23*	19,81 ± 1,68	19,43 ± 2,06	14,0 ± 0
P 3 , с	9,44 ± 0,75	44,03 ± 3,49*	37,47 ± 3,25*	41,79 ± 4,07*	39,6 ± 5,56*
P 4 , нг/мл	6,23 ± 0,32	22,22 ± 7,4*	26,66 ± 6,85*	14,82 ± 2,89*	27,6 ± 5,54*
fW, ед./мл	0,69 ± 0,03	1,04 ± 0,12*	1,1 ± 0,10*	0,88 ± 0,11	2,01 ± 0,01*
Гомоцистеин, мкмоль/л	9,98 ± 0,44	10,33 ± 1,06	12,18 ± 1,54	11,57 ± 1,13	6,13 ± 0,01*
Эндотелин, фмоль/мл	0,29 ± 0,02	0,25 ± 0,01	0,35 ± 0,05	0,48 ± 0,07*	4,29 ± 0,01*

Примечание. СА - степень агрегации тромбоцитов; t МРА - время достижения максимального размера агрегатов; МРА – скорость достижения максимального размера агрегатов; t МСМРА – время достижения максимальной скорости образования максимального размера агрегатов; СА – степень агрегации; t МА – время достижения максимальной агрегации; МСА – максимальная скорость агрегации; t МСА – время достижения максимальной скорости агрегации; Р 3 и P 4 – тромбоцитарные факторы 3 и 4 соответственно; fW – ф. Виллебранда; * – достоверные отличия от контроля.

после 1-го цикла на 13 и сохранилась повышенной на 18 % до 12-го цикла (сравнения с контрольной группой). Выросла и максимальная скорость агрегации (МСА) после 1-го цикла (на 48 %), оставаясь такой и после 6-го цикла. Значительно вырос плазменный уровень тромбоцитарных факторов: ф. Р₃ после 1-го цикла – на 366 %, после 3-го – на 299 %, после 6-го – на 342 % и после 12-го – на 319 % (относительно контроля). Вырос и уровень ф. Р 4 : после 1-го цикла – на 256 % и после 12-го – на 343 %.

Изменился и сосудистый компонент: уровень ф. Виллебранда вырос после 1-го цикла на 50 %, после 12-го – на 191 %. Уровни гомоцистеина и эндотелина имели тенденцию к росту уже после 1-го цикла и снизились после 12-го цикла.

В коагуляционном звене сдвиги (активация) возникают позже, чем в сосудисто-тромбоцитарном (табл. 3). После 1-го цикла приема КОК уменьшилось МНО, увеличилась фибриногенемия и на 526 % увеличился уровень РКФМ. Признаки повышения свертываемости крови усилились после 3-го цикла: укорочение ПТВ и ТВ, уменьшение МНО и ПО на фоне роста ПТИ.

Уровень РКФМ и концентрация фибриногена были повышены весь период наблюдений. Активность АТ III несколько увеличилась после 1-го цикла, резко упала после 3-го цикла, оставаясь сниженной после 12-го цикла.

Переходя к анализу ЛПО в эритроцитах, напомним, что индекс окисленности липидных (ИОЛ) компонентов этих клеток в гептановой и изопро-панольной фазах – это отношение содержания липидпероксидов гептановой и изопропанольной фаз к содержанию соединений с изолированными двойными связями, а степень ненасыщенности остатков жирных кислот (СНОЖК) липидных молекул рассчитывается как отношение липидов изопропанольной фазы к липидам гептановой фазы на соответствующих длинах волн. Оказалось, что в гептановой фазе экстракта из эритроцитов крыс уровень МДА повышен после 1-го цикла на 32 %, после 3-го – на 38 %, после 6-го – на 50 % и после 12-го – на 40 %; количество ДК после 12-го цикла увеличилось на 129 %, а количество шиффовых оснований после 1-го цикла выше уже на

200 %. В изопропанольной фазе уровень ДК выше после 6-го цикла на 72 %, а СТ + КТ после 3-го цикла – на 65 %. В гептановой фазе выросли и ИОЛ из эритроцитов: их прирост для молекул ДК после 1-го цикла – 141 %, после 3-го – 204 %, после 6-го – 265 %, после 12-го – 128 % (везде р < 0,05).

СНОЖК в молекулах ДК проявила тенденцию к росту уже после 3-го цикла и увеличилась на 75 % после 12-го цикла, а в молекулах сопряженных триенов и кетодиенов (вторичные продукты ЛПО) после 3-го цикла увеличилась на 345 % и после 6-го – на 296 %.

Изменения ЛПО сопровождаются и сдвигами антиоксидантной активности плазмы (табл. 4). Так, наметившаяся после 1-го цикла тенденция к снижению Г-S-Т сохранялась весь период наблюдений и усилилась к концу 12-го цикла приема КОК: после 3-го цикла Г-S-Т снижен на 49 %, после 6-го – на 71 % и после 12-го – на 83 %. После 1-го же цикла снизился и уровень витамина Е (на 8 %), оставаясь примерно таким же и после 12-го цикла.

Таблица 3

Коагуляционное звено гемостаза у женщин на фоне приема

30 мкг этинилэстрадиола с 3 мг дроспиренона ( n в группе, получавшей КОК, равно 50)

Показатель	Контроль, n = 64	После 1-го цикла	После 3-го цикла	После 6-го цикла	После 12-го цикла
АВР, с	97,89 ± 2,56	105,27 ± 2,47	101,37 ± 2,68	99,85 ± 3,32	94,27 ± 3,36
АЧТВ, с	28,31 ± 0,02	27,39 ± 0,47	28,71 ± 1,05	29,13 ± 0,63	28,49 ± 0,55
ПО	1,08 ± 0,01	1,05 ± 0,01	1,03 ± 0,01*	1,03 ± 0,01*	1,04 ± 0,01*
ПТИ, %	91,25 ± 2,18	95,65 ± 1,18	96,26 ± 0,81*	96,61 ± 0,82*	96,11 ± 1,28
МНО	1,12 ± 0,02	1,06 ± 0,02*	1,07 ± 0,28*	1,02 ± 0,1*	1,06 ± 0,02*
ПТВ, с	14,24 ± 0,29	13,4 ± 0,44	12,93 ± 0,36*	12,28 ± 0,38*	12,4 ± 0,7*
ТВ, с	16,24 ± 0,40	16,27 ± 0,48	16,14 ± 0,53*	15,08 ± 0,52*	17,26 ± 0,67
ФГ, г/л	3,24 ± 0,09	3,99 ± 0,52*	3,65 ± 0,13*	3,61 ± 0,13*	3,76 ± 0,19*
РКФМ, г/л	1,27 ± 0,39	7,96 ± 1,11*	7,29 ± 1,1*	6,45 ± 1,01*	8,59 ± 1,44*
АТ III, %	112,26 ± 1,55	120,63 ± 0,24	104,38 ± 3,58*	107,00 ± 3,18	100,4 ± 7,69
ИРП, %	98,73 ± 0,84	97,29 ± 1,54	97,55 ± 1,66	97,6 ± 1,53	100,0 ± 0,95
D-димеры	0,11 ± 0,01	0,125 ± 0,01	0,16 ± 0,04	0,12 ± 0,02	0,16 ± 0,04

Примечание. Все аббревиатуры расшифрованы в разделе «Материалы и методы»; * – величины, достоверно отличающиеся от контроля ( р < 0,05).

Таблица 4

Антиоксидантная активность плазмы женщин, получавших

30 мкг этинилэстрадиола с 3 мг дроспиренона ( n в группе, получавшей КОК, равно 15)

Показатель	Контроль, n = 54	После 1-го цикла	После 3-го цикла	После 6-го цикла	После 12-го цикла
Г-S-Т, мкмоль/мл/мин	562,14 ± 60,85	339 ± 74,4	282,8 ± 54,35*	159,22 ± 21,36*	95,53 ± 67,64*
СОД, % торможения	46,44 ± 3,97	52,1 ± 7,02	38,89 ± 6,41	50,77 ± 9,54	50,8 ± 4,88
Витамин А, мкг/мл	0,75 ± 0,02	0,78 ± 0,01	0,7 ± 0,9	0,79 ± 0,02	0,83 ± 0,03
Витамин Е, мкг/мл	8,72 ± 0,15	8,08 ± 0,27*	8,88 ± 0,4	8,71 ± 0,28	8,36 ± 0,3

Примечание. * – величины, достоверно отличающиеся от контроля ( р < 0,05).

Проблемы здравоохранения

Выводы. Применение современных низкодо-зированных КОК (30 мкг этинилэстрадиола и 3 мкг дроспиренона – селективного прогестагена четвертого поколения с антиминералокортикоидным и антиандрогенным эффектом) активирует сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз уже к концу 1-го цикла, что проявляется ростом агрегабельности тромбоцитов, повышением активности ф. Виллебранда, уровня гомоцистеина и эндотелина, гиперкоагулемией и ускорением непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, снижением антитромбиновой активности крови. Эти сдвиги отчасти ослабляются после 12-го цикла, хотя признаки напряжения в гемостазе все еще сохраняются.

Следует настоятельно рекомендовать женщинам, использующим КОК в целях контрацепции или лечения, находиться под постоянными наблюдением акушеров-гинекологов (оценка гемоста-зиограммы каждые 3 цикла, особенно в первый год использования половых стероидов).

Выявленные гемостатические сдвиги сопряжены с активацией ЛПО в клетках крови и снижением активности антиоксидантных систем. Полученные данные – основание для попыток коррекции гемостатических сдвигов на фоне КОК через ограничение ЛПО.