Генетическая структура быков-производителей по гену основного фактора роста фибробластов в условиях Республики Татарстан

Факторы роста фибробластов (FGF) представляют собой большое семейство аутокринных и паракринных модуляторов, обнаруживаемых в различных многоклеточных организмах, включая беспозвоночных. Действие FGF не ограничивается ростом клеток, он также оказывает влияние на миграцию, дифференцировку и выживание клеток, ангиогенез и онкогенез [8].

Ген FGF2 расположен на хромосоме 17 между генами BBS12 и NUDT6 и имеет длину около 59 кб, включая 3 экзона, кодирующих белок из 156 аминокислот. Ген фактора роста фибробластов 2 ( FGF2 или основной) в большей степени экспрессируется в тековых клетках фолликулов крупного рогатого скота и стимулирует синтез эндометрия в матке во время эстрального цикла и на ранних сроках беременности.

Молочная железа крупного рогатого скота также продуцирует FGF. Из-за экспрессии гена FGF2 в молочной железе авторы пришли к мнению, что основной фактор роста фибробластов 2 важен для развития и изменения молочной железы. В некоторых исследованиях показано, что гены, зависящие от пути передачи сигнала интерферона-tau (IFNT) и плацентарного лактогена (CSH1), связаны с выработкой молока, здоровьем и фертильностью молочного скота. FGF2 контролирует экспрессию интерферона-tau (IFNT), являющегося особым фактором, способствующим успешному вынашиванию плода у жвачных животных.

Следовательно, ген FGF2 выступает хорошим геном-кандидатом, влияющим на показатели молочной продуктивности и воспроизводительной способности [9]. Репродуктивные показатели у высокопродуктивных молочных коров в настоящее время невысоки и продолжают снижаться, они характеризуются низкими показателями оплодотворения и сниженной выживаемостью эмбрионов [7]. Снижение воспроизводительных качеств молочного скота является общемировой проблемой.

Наследуемость показателей плодовитости, обычно используемых в животноводстве, относительно невысока, как следствие больших необъяснимых остаточных вариаций в статистических моделях, пытающихся предсказать такие признаки, как межотельный период и индекс стельности для каждой особи в популяции крупного рогатого скота. Сложность прогнозирования этих характеристик проявляется в низком проценте вариаций воспроизводительных качеств, которые объясняются, к примеру, показателями энергетического баланса.

Несмотря на то, что низкий коэффициент наследуемости признаков фертильности (2-15 %) указывает на незначительность генетики, по сравнению с правильно организованным менеджментом в хозяйстве, это не исключает ее важности исследования при оценке животных. Кроме того, сообщалось о том, что вследствие игнорирования маркерной селекции, главным образом, по этим показателям произведены существенные генетические эффекты [10]. Н. Khatib и соавторы (2012) подсчитали, что, примерно, на треть случаев снижения индекса стельности дочерей приходится генетика [5].

Таким образом, надлежащий отбор быков представляется эффективной стратегией для решения текущих проблем в области воспроизводства крупного рогатого скота [10].

Выявление «желательных» аллелей генов, оказывающих влияние на репродуктивные свойства, облегчило бы генетическое тестирование быков, что позволило бы быстро и точно оценить их плодовитость и выживаемость потомков, зачатых от них. Кроме того, идентификация генов, влияющих на воспроизводительные признаки, может облегчить отбор с помощью маркеров, что снизит высокую стоимость тестирования потомства, используемого в настоящее время для улучшения маркерных показателей быков-производителей.

Зарубежными авторами было обнаружено, что SNP11646 оказывает значительное влияние на выживаемость эмбрионов. Жизнеспособность эмбрионов, полученных от коров GG -типа, поэтому SNP составляла 37 % против 28 и 29 % для эмбрионов, полученных от коров генотипов AG и AA , соответственно, это доказывает связь между полиморфизмом гена FGF2 и эмбриональной смертностью крупного рогатого скота [5].

Целью нашего исследования стало выявление полиморфизма гена FGF2 SNP11646 (замена A → G) в интроне 1 в поголовье быков-производителей АО ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Материал и методы исследований. Исследования проводили на базе АО ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан на 67 быках молочных и мясных пород и в отделе физиологии, биохимии, генетики и питания животных ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН. Образцы крови были отобраны при помощи вакуумных пробирок с ЭДТА-К3 (Apexlab, Китай). ДНК из биологического материала выделяли с использованием набора ДНК-Сорб В («АмплиСенс», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем.

Полиморфизм гена FGF2 определяли методом полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией эндонуклеазой RsaN I (СибЭнзим, Россия). В состав реакционной смеси (общий объем 20 мкл) входили олигонуклеотидные праймеры (Евроген, Россия) со следующей последовательностью:

FGF2 F: 5' -CATAGTTCTGTAGACTAGAAG - 3'

R: 5' - CCT CTA AAG AAG GAT TAA GTC AAA ATG GGG CTG GTA - 3'.

Адаптированный протокол ПЦР-ПДРФ описан в статье «Полиморфизм гена фактора роста фибробластов 2 ( FGF2) у крупного рогатого скота голштинской породы в условиях Республики Татарстан» [3]

Электрофоретическое разделение полученных ПДРФ-продуктов проводили в 2,6 %-ном агарозном геле, с использованием бромида этидия. Визуализацию и документирование осуществляли при помощи специализированного оборудования «GelDoc Go» с программным обеспечением «Image Lab Touch» V. 3.0 (BIORAD, США).

Рассчитывали частоту встречаемости отдельных аллелей и генотипов. Вариабельность генотипов по гену FGF2 анализировали согласно закону генетического равновесия Харди-Вайнберга. Значимость различий между наблюдаемыми и теоретически ожидаемыми частотами генотипов определяли по критерию хи-квадрат (%2) [2].

Результат исследований. При выполнении полимеразно-цепной реакции, нацеленной на обнаружение SNP11646 (A

→ G) гена FGF2 с проведением рестрикции эндонуклеазой RsaN I , были установлены три генотипа: AA , AG и GG (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР-ПДРФ в агарозном геле. Обозначения: М – ДНК-маркер 1500-50 bp (СибЭнзим); 1, 2, 4, 9 – генотип AG (207, 171 bp);

3, 5, 6, 8 – генотип GG (171 bp); 7) AA (207 bp).

Изображение иллюстрирует электрофоретическое разделение продуктов гидролиза. На нем наглядно показаны различные комбинации длин рестрикционных фрагментов, соответствующих генотипам быков. Количество оснований генотипов гена

FGF2 SNP11646 (A → G): AA –207 п.о.; AG – 207, 171 п.о.; GG – 171 п.о. При изучении полиморфизма гена основного фактора роста фибробластов 2 нами было выявлено распределение аллелей и генотипов в исследуемом поголовье быков, представленное в таблице 1.

Таблица 1 – Частота встречаемости аллелей и генотипов гена FGF2 (N = 67)

Распределение	n	Частота встречаемости генотипов						Частота аллелей		х2
		АА		AG		GG
		n	%	n	%	n	%	А	G
Наблюдаемое	67	16	23,9	22	32,8	29	43,3	0,403	0,597	6,71
Ожидаемое		10,9	16,2	32,2	48,1	24	35,6

В анализируемом поголовье быков АО ГПП «Элита» генотипы распределены относительно равномерно и наиболее часто встречаемый генотип среди исследуемого поголовья – GG – 43,3 % (29 гол.). Реже встречается генотип AG – 32,8 % (22 гол.), и, в свою очередь, самый малораспространенный генотип у быков – AA – 23,9 % (16 гол.). Частота встречаемости аллеля А составила 0,403, аллеля G – 0,597.

По критерию хи-квадрат соотнесли ожидаемое и наблюдаемое количество быков по всем рассматриваемым генотипам гена FGF2 SNP11646 (A → G) и затем выполнили вычисление. Итоговая величина хи-квадрат равняется 6,71, а, следовательно, критерий /2 немного выше %2крит(0,05) = 5,9, что нам говорит о сдвиге в сторону наращивания доли гомозиготных особей. Генетическое равновесие, согласно закону Харди-Вайнберга, в данной выборке нарушено.

Ранее в исследованиях отдела физиологии, биохимиии, генетики и питания животных ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН был произведен ДНК-анализ поголовья половозрелых коров (n=270) Республики Татарстан по гену основного фактора роста фибробластов 2 ( FGF2

SNP11646), в ходе которого были выявлены два аллеля ( A и G ) и три генотипа ( AA , AG и GG ). Распространенность «предпочтительного» аллеля G чуть выше, чем у «нежелательного» аллеля A , у изученного поголовья коров преобладает генотип AG , а сама популяция находится в генетическом равновесии [4].

Установленные нами частоты встречаемости генотипов и аллелей гена FGF2 SNP11646 (A → G) схожи с данными, полученными зарубежными авторами в Соединенных Штатах Америки [6].

Заключение. Было прогенотипировано 67 быков молочных и мясных пород АО ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан по гену FGF2 , определены два аллеля ( A и G ) и три генотипа ( AA , AG и GG ). Эти данные свидетельствуют о генетическом полиморфизме и биоразнообразии по исследуемому гену. В проанализированной выборке было установлено превалирование генотипа GG и аллеля G . Согласно критерию, хи-квадрат, выборка не имеет генетического равновесия.

Полученные нами новые данные могут быть использованы при селекции с использованием маркеров, так как потомство молодых быков может быть оценено сразу после рождения или даже до рождения, и те животные, у которых генетическим тестированием установлено наличие нежелательных аллелей в гомозиготном сочетании, никогда не будет тестироваться на наличие/отсутствие маркера.