Генетические и иммунологические маркеры чувствительности и эффекта у работников калийного производства в условиях комбинированного воздействия факторов риска

Лыхина Т.С., Вдовина Н.А., 2014

комбинации физических (шум) и химических (аэрозоли) вредных производственных факторов, особенно актуальной является задача своевременного выявления ранних маркеров возникающих патологических изменений [3, 9].

Цель работы – определить маркерные показатели нарушений иммунной и имму-ногенетической регуляции у работников калийного производства.

Материалы и методы . Группу наблюдения в условиях комбинированного воздействия вредных производственных факторов (пыль сильвинита, шум) составили 184 работника калийной горнорудной промышленности – мужчины, машинисты горных выемочных машин, средний возраст 36,6±1,0 г., средний стаж 7,3±0,9 г. На работников основной группы воздействует целый ряд опасных и вредных производственных факторов (как физических, прежде всего, шум, так и химических – запыленность воздуха сильвинитовой пылью). Условия труда отнесены к вредным с отклонением от гигиенических нормативов 3-й степени 3-го класса (3.3 согласно P 2.2.2006 – 05). Группу сравнения составили 55 работников – мужчины, занятые профессиональной деятельностью на поверхности при отсутствии изучаемых вредных факторов, средний возраст – 40,2±2,7 г., средний стаж – 5,8±1,9 г. Группы были сопоставимы по возрасту, полу и стажу.

Исследовали следующие параметры иммунной системы: содержание сывороточных иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, показатели фагоцитарной активности при использовании в качестве объектов фагоцитоза формалинизированных эритроцитов барана, маркеры межклеточной иммунной регуляции (фактор некроза опухоли и эритропоэтин), а также маркер эндотелиальной дисфункции – васкулярный эндотелиальный фактор роста методом иммуно-ферментного анализа с помощью тест-систем. Статистический анализ проводили с помощью описательной статистики и двухвыборочного t -критерия Стьюдента.

Достоверность различий между группами считали значимой при р < 0,05.

Забор материала для ПЦР осуществлялся методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки, затем проводили выделение ДНК с помощью сорбентного метода, в основе которого лежит разрушение клеток с дальнейшей сорбцией нуклеиновых кислот на сорбент.

Для исследования полиморфных вариантов в изучаемых генах использовали методику ПЦР, в основе которой лежит реакция амплификации и детекция продуктов этой реакции в режиме реального времени с помощью флюоресцентных меток, которыми предварительно помечают используемые для реакции амплификации праймеры. Амплификацию и детекцию осуществляли с помощью термоциклера CFX96, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе.

Для одновременной детекции нескольких продуктов реакции используют разные флюоресцентные метки и зонды (мультиплексная ПЦР). В качестве праймеров применяли участок ДНК генов цитохрома Р-450 CYP1A1, копропорфириногеноксидазы (CPOX), фактора некроза опухоли (TNFα), васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), eNOS(G894T), APOE согласно методическим рекомендациям «Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов» (МР 4.2.007513 от 20.08.2013).

Для определения генотипа человека использовали метод аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров.

Обработка данных по генотипированию проводилась с использованием унифицированной программы «Ген Эксперт». Данная программа служит для расчета статистических параметров для исследований «случай–контроль», использующих SNP (диагностику однонуклеотидных полимор- физмов). Применялись статистические методы для описания равновесия частот генотипов и аллелей генов по равновесию Харди-Вайнберга.

Результаты и их обсуждение. По клинико-лабораторным исследованиям состояния здоровья работающих выявлены функциональные нарушения со стороны иммунной системы (табл. 1). В группе обследованных наблюдались достоверные изменения со стороны врожденного звена клеточного иммунного ответа по сравнению с показателями физиологической нормы. В 27,3 % слу- чаев выявлено угнетение фагоцитарных показателей иммунитета по критерию «абсолютный фагоцитоз», у 62,9 % – по критерию «процент фагоцитоза», у 76,5 % – по критерию «фагоцитарное число» (p < 0,05).

Сравнительная характеристика фагоцитарного звена с аналогичными показателями группы контроля также обнаружила достоверное снижение показателей фагоцитоза – абсолютного и относительного количества фагоцитов и фагоцитарного числа у 72,7; 70,5 и 67,4 % обследованных соответственно ( p < 0,05).

Таблица 1

Показатели иммунного статуса работников калийного производства и маркеры эффекта

Показатель	Группа сравнения ( n = 53)	Группа наблюдения ( n = 132)
Абсолютный фагоцитоз, 109/дм3	1,892±0,296	1,417±0,122*
Процент фагоцитоза, %	43,189±4,359	33,114±2,001*
Фагоцитарное число, усл. ед.	0,733±0,088	0,605±0,052*
Фагоцитарный индекс, усл. ед.	1,668±0,062	1,773±0,046
IgG, г/дм3	11,016±0,519	11,365±0,332
IgM, г/дм3	1,392±0,086	1,258±0,061*
IgА, г/дм3	2,327±0,173	2,296±0,104
Маркеры эффекта
Васкулярный эндотелиальный фактор роста, пг/см3	298,464±65,881	308,909±40,309
Фактор некроза опухолей, пг/см3	0,783±0,18	1,773±0,161*
Эритропоэтин, мМЕ/см3	–	19,891±5,429

Примечание: * – разница достоверна по отношению к группе сравнения ( р < 0,05).

Одновременно установлены достоверные разнонаправленные изменения содержания сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и G с преимущественным дефицитом IgМ и IgG (у 88,5 и 51,1 % проб) и гиперпродукцией IgA (у 87 % проб) по сравнению с референтным диапазоном. В то же время показано достоверное снижение уровня IgM относительно показателей в группе сравнения ( p < 0,05).

Уровень проапоптотического цитокина фактора некроза опухоли находился в пределах физиологической нормы, но был достоверно выше в 1,9 раза значений в группе сравнения (р < 0,05). Содержание эритропоэтина соответствовало референтным показателям, хотя превышение отмечено у 13,3 % работающих, достоверных отличий выявить не удалось. Маркер состояния эндотелия – васкулярный эндотелиальный фактор роста достоверно отклонялся от возрастной нормы по критерию кратности превышения при отсутствии значимых различий с группой сравнения.

Анализ результатов изучения полиморфизма генов цитохром-450 (CYP1A1), CPOX, VEGF, eNO-синтаза, ТNFα, eNOS, АРО позволил установить, что аллельный полиморфизм генов, отвечающих за иммунный ответ и апоптоз (ТNFα), характеризуется повышенной распространенностью минорного аллеля (в 2 раза) по сравнению с уровнем группы сравнения, прежде всего за счет гетерозиготного генотипа (табл. 2).

Полиморфизм гена VEGF отличался от такового в группе сравнения преимущественной распространенностью гена в мутантном гомозиготном состоянии. Полиморфизм генов эндотелиальной дисфункции (eNO-синтаза) был сопоставим в анализируемых группах.

Таблица 2

Распределение частот генов – маркеров чувствительности у работающих на калийном производстве

Генотип/аллель/маркер чувствительности		Группа наблюдения, n = 184	Группа сравнения, n = 55
VEGF	GG	52	54
	GC	37	42
	CC	11	4
	G	70	75
	C	30	25
cyp1A1(2) (А4889G)	AA	88	91
	AG	10	9
	GG	2	0
	A	93	95
	G	7	5
ТNFα	GG	78	89
	GА	21	9
	АА	1	2
	G	89	94
	А	11	6
eNOS(G894T)	GG	57	56
	GT	35	38
	TT	8	6
	G	75	75
	T	25	25
CPOX	АА	64	87,5
	АС	32	12,5
	СС	4	0
	А	80	93
	С	20	7
APOE (Cys130Arg)	TT	75	77
	TC	24	20
	CC	1	3
	T	87	88
	C	13	12

Полиморфизм генов детоксикации

CYP1A1, CPOX характеризует специфиче- ские различия между анализируемыми группами. Распространенность патологического аллеля CYP1A1 (ген цитохрома), отвечающего за 1-ю фазу детоксикации органических токсикантов превышает показатель группы сравнения за счет гомо- и гетерозиготного генотипа.

Выводы :

• 1.    У работников калийного производства установлены достоверные по отношению к физиологической норме и показателям группы сравнения существенные изменения в иммунной системе, характеризующиеся снижением активности фагоцитоза и гиперпродукцией маркеров цитокиновой регуляции: фактора некроза опухоли (TNFα) и васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), а также измененный полиморфизм кодирующих их участков генов в виде повышенной распространенности вариантных аллелей генов за счет минорного гомозиготного (VEGF) и гетерозиготного (TNFα) генотипов. Установленный измененный полиморфизм генов детоксикации CYP1A1, CPOX характеризует специфические различия с группой сравнения.

• 2.    Полученные данные позволяют рекомендовать выявленные негативные генетические ассоциации (гены TNFα, VEGF, CYP1A1, CPOX) в качестве маркеров чувствительности, а кодируемые ими цитокины (фактор некроза опухоли и эндотелиальный фактор роста) – в качестве маркеров эффекта при оценке риска здоровью работающих на калийном производстве.