Генетический анализ сортов и сомаклональных линий сои методом маркирования межмикросателлитных последовательностей (ISSR)

Введение. В селекционной практике некоторых сельскохозяйственных культур наряду с гибридизацией в настоящее время используется сомаклональная изменчивость как источник генетического разнообразия.

При использовании традиционного метода – гибридизации, исследователь руководствуется в процессе последующего отбора лишь теми изменениями в гибридной популяции, которые приводят к заметному разнообразию появляющихся фенотипов. В популяциях сомаклональных линий видимые морфологические изменения могут отсутствовать, тогда возникает необходимость использования генетических методов, с помощью которых можно было бы четко выявить различия между регенератами и исходной формой.

Исследования с использованием молекулярных маркеров осуществлялись целым рядом ученых с целью выявления полиморфизма дикой и культурной сои, а так же идентификации сортов [1-6] и гибридов F1 [7]. Метод RAPD (random amplified polymorphic DNA) оказался перспективным для определения уровня генетической изменчивости растений. Имеются результаты его применения с целью выявления генетических различий среди сомаклонов пшеницы, томатов, гороха и др. [8]. Группа бразильских ученых методом RAPD проанализировала полученные ими сомаклональные линии сои [9]. Ранее нами [10] проведена оценка генетической изменчивости трех сортов и восьми сомаклональных линий сои методом ISSR (маркирования меж-микросателлитных последовательностей) с участием праймеров к различным ди- и тринуклеотидным микро-сателлитным повторам. Сомаклоны сортов сои отличаются от исходных форм по ряду количественных признаков [11, 12], степени устойчивости к пероноспорозу, септориозу и церкоспорозу [13]. Сравнение морфологических признаков показало, что между исходной формой (сортом) и линиями, а также между линиями одной группы, различия отсутствуют.

Цель настоящей работы – на основе анализа методом ISSR генетической изменчивости и взаимо-отно-шений между сомаклональными линиями сои и исходными формами отобрать для дальнейшего селекционного процесса наиболее перспективные сомаклональные линии сои, полученные в Приморском НИИСХ.

Материалы и методы. Методика проведения генетического анализа подробно описана нами ранее [10]. Анализ генетических данных проводили по группам, каждая из которых включала исходную форму (и.ф.) – сорт, и ее сомаклональные линии. Группа I – сорт Приморская 301 и линии R1, R13.3, R206, R312, R362; группа II – сорт Приморская 529 и линии R113, R349, R351, R423, R451, R461; группа III – сорт Венера и линии R78, R219, R229, R499; группа IV – сорт Ходсон и линии R86, R304, R389, R397, R422, R436, R441, R565. Для генетического анализа были взяты также сорта Приморская 13, Приморская 69, Приморская 81 (R13.3), Витязь 50, Приморская 51, Марината и Вега. Всего проанализировано 336 растений сои.

Результаты и обсуждение. В группе I (и.ф. Приморская 301, n=68) сравнение ISSR-спектров позволило проследить вариабельность 353 фрагментов, из них 197 (55,8 %) были полиморфными. В спектрах со-маклональных линий обнаружено 68 новых ампликонов, отсутствующих у и.ф. С помощью праймера 880 (GGA GAG GAG AGG AGA) выявлен маркерный фрагмент 925 пн, присутствующий у всех представителей сомаклональной линии R1 и отсутствующий в других. Линии R206 и R312 отличались от всех других присутствием двух фрагментов – 375 и 490 пн, выявленных с помощью праймеров C3 [(AGC) 6 C] и S10 [(GA) 8 TC] соответственно. Следует отметить, что только в этих линиях отсутствовал фрагмент 1580 пн (праймер C3), который присутствовал в спектрах других представителей этой группы.

В группе II (и.ф. Приморская 529, n=70) сравнение ISSR-спектров позволило проследить вариабельность 374 фрагментов, из них 242 (64,7 %) были полиморфными. В спектрах сомаклональных линий этой группы обнаружен 81 новый ампликон, отсутствующий у и.ф. Выявлены маркерные фрагменты: сорт Приморская 529 маркируется фрагментами 1970 и 1660 пн, полученными с праймером C1 [(AGC)₆T], линия R113 – фрагментами 635 и 455 пн с праймерами 808 [(AG)₈C] и S9 [(CA)₈GT] соответственно линия R423 – фрагментом 1020 пн (праймер S10). В спектрах сорта Приморская 529 и линий R113, R423 и R461, полученных с праймерами 808, 834 ((AG) 8 (CT)T), 840 [(GA) 8 (CT)T], 856 [(AC) 8 (CT)A] и 868 [(GAA) 6 ], обнаружены общие с представителями группы I мономорфные и высокомолекулярные (от 1250 до 1650 пн) фрагменты.

В группе III (и.ф. сорт Венера, n=50) сравнение ISSR-спектров позволило проследить вариабельность 330 ампликонов, из них 180 (54,6 %) были полиморфными. В спектрах сомаклональных линий обнаружено 55 новых фрагментов, отсутствующих у и.ф., из них 10 являются мономорфными. В то же время сорт маркируется 31 мономорфным фрагментом, отсутствующим в спектрах сомаклональных линий.

В группе IV (и.ф. сорт Ходсон, n=90), включающей наибольшее количество анализируемых сома-клональных линий, сравнение ISSR-спектров позволило проследить вариабельность 363 фрагментов, из них 234 (64,5 %) были полиморфными. В спектрах сомаклональных линий обнаружено 67 новых ампликонов, отсутствующих в спектрах и.ф., из них только два мономорфные. У сорта Ходсон выявлено 4 маркерных фрагмента. Линия R304 отличается от всех исследованных популяций этой группы отсутствием в спектрах, полученных с праймером 817 [(CA) 8 A], фрагмента 940 пн, а линия R86 – отсутствием фрагментов длиной 460 и 490 пн.

Появление новых ампликонов у сомаклонов является отражением происходящих генетических изменений, которые затрагивают структуру ISSR-локусов при сохранении большей части фрагментов, характерных для ДНК растений исходных сортов.

В суммарной выборке 11 сортов (Приморская 81 – Приморская 13 – Приморская 51 – Приморская 69 –Приморская 301 – Приморская 529 – Витязь 50 – Венера – Вега – Марината – Ходсон, n=109) проанализировано 383 фрагмента, из них 290 (75,7 %) были полиморфными. Обнаружены сортоспецифичные маркеры. Например, с помощью праймера 808 выявлены диагностические маркеры для сортов Приморская 13 (1750 пн) и Приморская 51 (1070 пн), Приморская 69 маркируется фрагментом длиной 810 пн, полученным с праймером 888 [(CGT) (ACT) (CGT) (CA)7], сорт Венера – фрагментом 990 пн, полученным с праймером 834. Наибольшее количество маркеров (семь) обнаружено у сорта Витязь 50, что не удивительно, т. к. сорт получен при скрещивании двух американских сортов Эванс и Ходсон. Кроме того, выявлены общие мономорфные локусы для групп сортов.

На основании аллельных частот рассчитаны основные показатели генетической изменчивости исследуемых сортов и сомаклональных линий (табл. 1). Из 23 исследуемых сомаклональных линий 13 характеризовались большим генетическим разнообразием, чем их исходные формы. Наименьший уровень генетического полиморфизма определен у сорта Приморская 69, наибольший – у сорта Вега. На межсортовую изменчивость приходится около 69 % от общей изменчивости, а на внутрисортовую – около 31 % ( F _ST = 0,688). Значения генетических дистанций ( D N ) варьируют между разными парами сортов, достигая 5-кратного различия.

Таблица 1 – Основные показатели генетической изменчивости исследуемых сортов и сомаклональных линий сои

	Сорт / линия	P 95 , %	H	SI
I	Приморская 301 (иф)	18,.1	0,072	0,105 (0,23)
	R 206	21,0	(0,16)	0,114 (0,23)
	R 312	19,0	0,077	0,103 (0,23)
	R 1	18,4	(0,16)	0,096 (0,21)
	R 13.3 (Приморская 81)	19,0	0,070	0,108 (0,23)
	R 362	24,4	(0,16) 0,064 (0,15) 0,074 (0,16) 0,090 (0,17)	0,133 (0,25)
II	Приморская 529 (иф)	20,9	0,071	0,106 (0,22)
	R 351	16,3	(0,15)	0,085 (0,20)
	R 461	20,9	0,057	0,109 (0,23)
	R 451	15,0	(0,14)	0,079 (0,20)
	R 349	16,0	0,073	0,086 (0,21)
	R 113	19,2	(0,16)	0,102 (0,22)
	R 423	15,5	0,053 (0,14) 0,058 (0,14) 0,069 (0,15) 0,059 (0,15)	0,087 (0,21)
III	Венера (и.ф.)	16,7	0,060	0,089 (0,21)
	R 219	24,2	(0,14)	0,111 (0,22)
	R 229	22,7	0,072	0,116 (0,23)
	R 78	10,9	(0,15)	0,054 (0,16)
	R 499	10,9	0,077 (0,16) 0,036 (0,11) 0,037 (0,11)	0,056 (0,17)
IV	Ходсон (и.ф.)	17,1	0,058	0,088 (0,20)
	R 304	20,7	(0,14)	0,109 (0,23)
	R 441	19,8	0,073	0,099 (0,21)
	R 436	21,8	(0,16)	0,110 (0,22)
	R 86	20,1	0,065	0,104 (0,21)
	R 397	19,0	(0,14)	0,096 (0,21)
	R 389	22,3	0,073	0,111 (0,22)
	R 422	12,4	(0,15)	0,069 (0,19)
	R 565	23,1	0,069 (0,15) 0,063 (0,14) 0,073 (0,15) 0,047 (0,13) 0,077 (0,15)	0,117 (0,23)
Приморская 13		24,8	0,085 (0,16)	0,128 (0,24)
Приморская 51		14,4	0,046 (0,12)	0,070 (0,18)
Приморская 69		13,8	0,046 (0,13)	0,070 (0,19)
Витязь 50		14,9	0,042 (0,12)	0,066 (0,18)
Вега		25,3	0,091 (0,17)	0,136 (0,25)
Марината		20,4	0,070 (0,15)	0,105 (0,22)
Суммарная выборка 11 сортов		63,4	0,218 (0,19)	0,333 (0,27)

Примечание: P ₉₅ – доля полиморфных локусов; H – генное разнообразие;

SI – индекс Шеннона. В скобках даны значения среднего отклонения

Наименьшим генетическим различием ( D _N=0,0550) характеризуются сорта Вега и Марината, а наибольшим – сорта Приморская 51 и Витязь 50 ( D _N=0,2929), Приморская 81 и Вега ( D _N=0,2958) и Приморская 81 и Марината ( D N =0,2922). Дендрограмма генетических взаимоотношений исследованных сортов представлена на рисунке 1.

Значения D N между разными парами выборок в рамках отдельно взятой группы также варьируют. Например, в группе I они достигают 5-кратного различия, а в группе IV – 15-кратного. Наименьшим генетическим различием ( D _N=0.0183) характеризуются сомаклональные линии R436 и R441, относящиеся к группе IV (и.ф. сорт Ходсон), а наибольшим ( D _N=0,3094) – линии R349 и R423 группы II (и.ф. сорт Приморская 529).

На дендрограммах генетических взаимоотношений между растениями сорта и сомаклональных линий в каждой отдельно взятой группе (рис. 2) только в группе II (рис. 2б) все образцы кластеризуются с умеренной и высокой степенью достоверности (индекс бутстрэпа от 56 до 100 %) в соответствии с принадлежностью их к определенной линии и сорту.

Рисунок 1 – Дендрограмма генетических взаимоотношений между 11 сортами сои, построенная по данным анализа 383 ISSR-локусов

Образцы линий R206, R312 группы I (рис. 2а) и линий R78, R499 группы III (рис. 2в) образуют смешанные кластеры, а в группе IV (рис. 2г) образцы только четырех линий (R86, R422, R565, R304) из восьми группируются в соответствии с их принадлежностью.

Иерархический анализ распределения генетической изменчивости по априорно сформированным группам (AMOVA) показал, что генетическое разнообразие между исходной формой и сомаклональными линиями одной группы (табл. 2) имеет значимые значения (P < 0,001) только в группе IV (и.ф. сорт Ходсон). Отрицательные значения компоненты изменчивости между исходной формой и сомаклональными линиями в группах I (и.ф. сорт Приморская 301) и II (и.ф. сорт Приморская 529) указывают на отсутствие генетической структуры в них. Анализ объединенной выборки групп I и II показал, что растения двух сортов и большинства линий обеих групп образуют один кластер (рис. 3, кластер выделен серым цветом) с низким уровнем достоверности (индекс бутстрэпа ниже 50 %). Это указывает на генетическую близость, которая объясняется их происхождением – при создании сорта Приморская 301 была использована гибридная комбинация (Прим. 529 × Prize) × {Прим. 529 × [Peking × (Прим. 529 × Амурская 41)]}, одним из участников которой был сорт Приморская 529. Сомаклональные линии, полученные от этих сортов, более сходны между собой (10,58 % от общей генетической изменчивости приходится на межпопуляционную изменчивость), чем популяции исходных сортов (67,56 % – на межсортовую изменчивость).

Рисунок 2 – Дендрограммы генетических взаимоотношений внутри исследуемых групп, образованных сортом (исходная форма) сои и иго сомаклональными линиями: а – группа I; б – группа II; в – группа III; г – группа IV.

Таблица 2 – Иерархическое распределение генетической изменчивости по результатам AMOVA

Источник генетического разнообразия	df	SSD	CV	%	Индекс фиксации
Группа I (и. ф. сорт Приморская 301)
Между и.ф. и группой сомаклональных линий	1	139,11	-5,16	-16,84	F CT = -0,168**
Между сомаклональными линиями	4	1069,38	21,75	70,99	F SC = 0,608*
Внутри линий	62	871,04	14,05	45,85	F ST = 0,541*
Общее	67	2079,53	30,64
Группа II (и. ф. сорт Приморская 529)
Между и.ф. и группой сомаклональных линий	1	286,25	-0,50	-1,23	F CT = -0,012**
Между сомаклональными линиями	5	1474,35	28,17	68,93	F SC = 0,681*
Внутри линий	63	831,70	13,20	32,30	F ST = 0,677*
Общее	69	2592,30	40,86
Группа III (и. ф. сорт Венера)
Между и.ф. и группой сомаклональных линий	1	500,19	24,40	53,65	F CT = 0,536**
Между сомаклональными линиями	3	329,12	9,85	21,65	F SC = 0,467*
Внутри линий	45	505,80	11,24	24,71	F ST = 0,753*
Общее	49	1335,12	45,49
Группа IV (и. ф. сорт Ходсон)
Между и.ф. и группой сомаклональных линий	1	358,52	6,45	14,54	F CT = 0,145*
Между сомаклональными линиями	7	1706,35	22,87	51,51	F SC = 0,603*
Внутри линий	81	1220,90	15,07	33,95	F ST = 0,660*
Общее	89	3285,77	44,40
Группа, объединяющая 11 сортов
Между сортами	10	3247,21	31,36	68,78	F ST = 0,688*
Внутри сортов	98	1395,01	14,23	31,22
Общее	108	4642,22	45,59
Группа, объединяющая сомаклональные линии групп I и II
Между сомаклональными линиями группы I и II	1	113,86	0,96	10,58	F CT = 0,106***
Между сомаклональными линиями в группе	9	489,22	4,75	52,34	F SC = 0,585*
Внутри линий	108	363,62	3,37	37,08	F ST = 0,629*
Общее	118	966,71	9,08

Примечание : df – число степеней свободы; SSD – сумма квадратов; CV – абсолютное значение компоненты изменчивости; % – процент генетической изменчивости; F _ST – межпопуляционная изменчивость, F _SC – изменчивость, связанная с различием популяций внутри априорно сформированных групп, F _CT – изменчивость, связанная с межгрупповыми различиями, *P < 0,001, **P > 0,20, ***P < 0,02.

Рисунок 3 – Некорневая дендрограмма генетических взаимоотношений растений сортов Приморская 301 и Приморская 529 и их сомаклональных линий. Серым цветом выделен кластер, который объединяет линии и сорта двух групп

Таким образом, по результатам ISSR-анализа рекомендованы для дальнейшего селекционного процесса следующие сомаклональные линии: из группы I – R1 и любая из линий R206, R312; из группы II – одна из 3-х линий R349, R351, R451; из группы III – R229 и R219, и одна из линий R78, R499; из группы IV (и.ф. сорт Ходсон) – R304 или R565, и одна из линий R397, R389, R436, R441. Полученный перечень линий скорректирован с информацией об изменчивости количественных признаков и степени устойчивости к заболеваниям и передан селекционерам ПримНИИСХ для использования.

Выводы. Выявлен достаточно высокий уровень межсортового ISSR-полиморфизма сои. Использование метода культуры ткани для селекции сои не всегда приводит к повышению генетического разнообразия. Впервые отмечено, что сомаклональные линии, полученные от разных, но генетически близких сортов сои, более сходны между собой, чем популяции исходных сортов. Данные ISSR-анализа могут быть использованы для отбора лучших растений в пределах сомаклональной линии, повышая эффективность селекции, а так же для идентификации и паспортизации сортов сои.