Генетический маркер коллагена ITGA2 в оценке эффективности антиагрегантного эффектапрепаратов ацетилсалициловой кислоты

Введение. Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов нарушения агрегации тромбоцитов связан с выделением генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания. Изучение генетических аспектов тромбоза свидетельствует о преобладании последнего у людей с «неблагоприятными» аллелями белков-участников гемостатического каскада [1–3].

Известно, что аллель T полиморфного маркера C807T гена ITGA2 ассоциирована с повышенной экспрессией GPIa-рецепторов тромбоцитов и повышенной адгезией тромбоцитов к коллагену. При этом повышенная экспрессия рецепторов GPIa/IIa обнаружена на поверхности тромбоцитов у гомозигот по аллели Т (генотип Т/Т), в то время как у гомозигот по аллели С (генотип С/С) наблюдается снижение экспрессии. Наличие Т-аллели ассоциируется с увеличением скорости адгезии тромбоцитов, а следовательно, и с повышением риска развития инфаркта миокарда, ишемического инсульта, тромбоэмболии [4–7] и может быть использовано, по мнению авторов, для оценки риска развития тромбозов после ангиопластики и стентирования коронарных артерий.

Исследование HAPI по изучению реактивности тромбоцитов у женщин и мужчин после терапии аспирином подтверждает роль наследственных факторов в формировании изменчивости функции тромбоцитов до и после терапии аспирином [8, 9]. Авторы считают невозможным предусмотреть развитие резистентности, а у женщин с сердечно-сосудистыми заболеваниями резистентность к аспирину способствует более высокому риску развития острых коронарных синдромов.

Согласно меморандуму рабочей группы по изучению резистентности к аспирину Международного общества по тромбозу и гемостазу [10], среди возможных механизмов неэффективности терапии аспирином рассматривается генетический полиморфизм рецепторов GPIIb/IIIa. Неоднозначная интерпретация генетических маркеров развития тромбоза, неизученность связи последних с функциональным состоянием тромбоцитов определили актуальность выбранной темы исследования.

Цель исследования. Изучить эффективность препаратов ацетилсалициловой кислоты у пациентов с полиморфизмом гена рецептора коллагена ITGA2.

Материалы и методы. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из цельной крови пациентов с использованием набора «ДНК-Экспресс» («Литех», Россия). Полиморфизм гена определяли с использованием реагентов фирмы «Литех» методом ПЦР в реальном времени. Амплификацию и плавление ее продуктов проводили на ам-плификаторе с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени CFX96Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США).

Агрегацию тромбоцитов определяли при помощи 2-канального лазерного анализатора 230LA (BIOLA Ltd, Россия) методом световой агрегометрии. Исследовалась спонтанная и индуцированная агрегация тромбоцитов. В качестве индуктора агрегации использовался аденозиндифосфат (АДФ) в концентрациях 0,1; 1,0 и 5,0 мкмоль. Степень спонтанной агрегации и агрегации, индуцированной 0,1 и 1,0 мкмоль АДФ, определяя-ли как максимальное значение среднего размера агрегатов и измеряли в относительных единицах. Степень агрегации, индуцированной АДФ в концентрации 5,0 мкмоль, опре- деляли как максимальное приращение свето-пропускания после добавления индуктора и измеряли в процентах. Нормальными принимались значения: для спонтанной агрегации – 1,0–1,5 отн. ед., для индуцированной 0,1 мкмоль АДФ – 1,0–2,0 отн. ед., для индуцированной 1,0 мкмоль АДФ – 1,5–5,5 отн. ед., для индуцированной 5,0 мкмоль АДФ – 25–70 %.

Результаты и обсуждение. В исследование были включены 88 пациентов с ИБС и сопутствующей АГ (возраст больных – от 41 до 91 года; средний возраст – 69,9±12,3 года). Средний возраст группы здоровых лиц – 47,60±8,11 года. Мужчины составили 42 %, а женщины – 58 % обследованных. Все пациенты получали базисную терапию ИБС и АГ (β-адреноблокаторы, ИАПФ, статины) и препараты ацетилсалициловой кислоты (аспирин – 100 мг/сут, кардиомагнил – 75 мг/сут).

Оценка распределения аллельного полиморфизма гена ITGA2 показала преобладание Т-аллели. Так, среди больных было выявлено 30,7 % гомозигот по 1-й аллели (С/С), 22,7 % гомозигот по 2-й аллели (Т/Т) и 46,6 % гетерозигот (С/Т). Среди здоровых – 80 % гомозигот по 1-й аллели (С/С), 20 % гетерозигот (С/Т); гомозигот по 2-й аллели (Т/Т) выявлено не было. Таким образом, у большинства (77,3 %) больных была обнаружена нуклеотидная замена в гене ITGA2 хотя бы в одной из хромосом. В контрольной группе, напротив, не наблюдалось наличия гомозигот по Т-аллели и преобладали гомозиготы по аллели С.

Распределение типа агрегации тромбоцитов по полиморфизму ITGA2 (табл. 1) показало преобладание среди пациентов с повышенной остаточной агрегацией тромбоцитов генотипов С/Т и Т/Т. Пациенты с гипоагрегацией характеризовались практически равномерным распределением генотипов С/С и Т/Т. Нормальные параметры агрегации тромбоцитов были выявлены преимущественно у пациентов с С/С-генотипом.

Распределение типов агрегации между различными генотипами было проверено парным t-тестом. Различия в распределении типов агрегации оказались статистически незначимыми (С/С и С/Т: p=0,1; C/C и T/T: p=0,05; C/C и T/T: p=0,4).

Таблица 1

		Тип агрегации			Итого
		Гиперагрегация	Гипоагрегация	Норма
Генотип	С/С	11 (35,5 %)	7 (22,6 %)	13 (41,9 %)	31
	С/Т	24 (57,1 %)	8 (19,1 %)	10 (24,8 %)	42
	Т/Т	13 (68,4 %)	3 (15,8 %)	3 (15,8 %)	19
Итого		48	18	26	92

Распределение типа агрегации по полиморфизму ITGA2

Оценка спонтанной и АДФ-индуциро-ванной агрегации тромбоцитов не выявила значимых различий в распределении типов агрегации между различными генотипами (χ2=0,17) (табл. 2).

Распределение показателей агрегации у пациентов с полиморфизмом ITGA2 было проверено на нормальность методом Колмогорова–Смирнова. Данные имели ненормаль- ное распределение, поэтому для выявления достоверности различий в показателях агрегации тромбоцитов был использован тест Крускала–Уоллиса. Тест показал статистически значимые различия в показателях спонтанной агрегации тромбоцитов (p=0,01) и отсутствие различий при индукции агрегации тромбоцитов АДФ.

Таблица 2

Распределение показателей агрегации тромбоцитов по полиморфизму ITGA2

Генотип		Спонтанная агрегация	АДФ 0,1 мкмоль	АДФ 1 мкмоль	АДФ 5 мкмоль
С/С, n=31	Среднее	1,5468	2,2787	3,1552	40 %
	Станд. отклонение	0,64019	1,32059	1,76522	15,3 %
	Медиана	1,4	1,85	3,30	42 %
С/Т, n=42	Среднее	1,6752	2,5290	3,3452	38,9 %
	Станд. отклонение	0,77846	1,19747	1,57775	15,5 %
	Медиана	1,45	2,45	3,05	40,45 %
Т/Т, n=19	Среднее	2,5721	2,6716	3,6642	44,2 %
	Станд. отклонение	1,39672	1,00877	1,58407	24 %
	Медиана	2,15	2,70	4,10	38 %
Итого	Среднее	1,8172	2,4741	3,3471	40,4 %
	Станд. отклонение	0,97326	1,20201	1,63667	17,4 %
	Медиана	1,50	2,30	3,35	40,65 %

Известно, что степень АДФ-индуциро-ванной агрегации зависит от количества АДФ-рецепторов [11].

Для выявления достоверности различий в спонтанной агрегации тромбоцитов был ис- пользован однофакторный дисперсионный анализ, парный t-тест (с поправкой Бонфер-рони, различия считались статистически значимыми при p<0,17 (0,05/3)) и тест Тьюки. Выявлено (рис. 1) наличие статистически значимых различий в показателях спонтанной агрегации тромбоцитов (p<0,001). По данным парного t-теста, между генотипами С/С и С/Т статистически значимых различий выявлено не было (p=0,55), генотип Т/Т статистически значимо отличался как от генотипа С/С (p<0,001), так и от генотипа С/Т (p=0,001). Тест Тьюки (рис. 2) также под- твердил значимые отличия в спонтанной агрегации тромбоцитов для носителей генотипа Т/Т по сравнению с носителями генотипов С/Т и С/С. Разница в среднем размере агрегата составила 1,0253311 (95 % ДИ (0,4; 1,65)) для С/С и Т/Т и 0,9 (95 % ДИ (0,30; 1,49)) для С/T и Т/Т.

Рис. 1. Средний размер агрегатов (спонтанная агрегация тромбоцитов)

Рис. 2. Тест Тьюки (спонтанная агрегация тромбоцитов)

Данные литературы о связи различных полиморфных маркеров генов-кандидатов с эффективностью терапии основными классами антитромбоцитарных препаратов немногочисленны.

В последние годы активно обсуждается проблема недостаточной активности (аспи-ринорезистентности) терапии препаратами ацетилсалициловой кислотой [12–15]. Есть основания полагать, что резистентность к терапии может быть связана с полиморфизмом гена, кодирующегогликопротеиновыерецеп-торы тромбоцитов [16, 17].

Известно, что ген ITGA2 кодирует ин-тегрин альфа-2, известный также как GPIa – мембранный гликопротеин, экспрессирующийся на мембранах различных клеток, включая мегакариоциты, фибробласты и тромбоциты, и образующий комплексы с тканевыми белками [18]. Одновременно с этим комплекс GPIa и GPIIa служит одним из главных рецепторов коллагена, расположенных на клеточной мембране тромбоцитов иявляющихся активатором агрегации тромбоцитов [19].

Установление ведущей роли тромбоцитарного звена гемостаза в патогенезе атерот-ромбоза способствовало разработке большого количества лекарственных препаратов, показавших в крупных многоцентровых исследованиях свою эффективность у больных с острыми коронарными синдромами и хроническими формами ИБС, в т.ч. при чрескожных реваскуляризационных процедурах [20, 21].

Одной из возможных причинрезистент-ности к аспирину у пациентовна фоне антиагрегантной терапии является преобладание среди них лиц с повышенной экспрессиейре-цепторов GPIa/IIa.

Известно, что индуцируемые реакции тромбоцитов пропорциональны количеству формирующихся комплексов «агонист-рецептор». Ответ на антиагрегантные лекарственные препараты будет зависеть от плотности соответствующих рецепторов на мембране тромбоцитов. Исследования антагони- стов GPIIb-IIIa-рецепторов показали, что интенсивность тромбоцитарной агрегации строго коррелирует с количеством свободных рецепторов на поверхности клеток [22]. Для проверки гипотезы о связи повышенной агрегации тромбоцитов с геном, кодирующим ин-тегрин альфа-2, мы провели изучение связи агрегации тромбоцитов у принимающих препараты ацетилсалициловой кислоты с аллельным полиморфизмом гена ITGA2. Полученные результаты исследования свидетельствуют о преобладании аллели Т у пациентов с повышенной агрегацией тромбоцитов. Однако, возможно, недостаточный объем выборки предопределил отсутствие значимых различий в распределении типов агрегаций между различными генотипами, что предполагает дальнейшее изучение данной проблемы с расширением контингента обследуемых. В связи с тем, что в настоящее время не представляется возможным выделить генетические предикторы эффективности применения того или иного антиагреганта, требуется проведение дальнейших исследований, а наличие выявленной «неблагоприятной» полиморфной аллели (Т-аллели) является только вероятностным показателем, значение которого нельзя переоценивать.

Заключение. Таким образом, продолжение исследований по генотипированию в сочетании с тестированием функциональной активности тромбоцитов может помочь врачам выбрать оптимальную тактику анти-тромбоцитарной терапии. Требуется проведение рандомизованных исследований, демонстрирующих преимущество индивидуализированной терапии антиагрегантами, основанных на результатах генетических и функциональных тестов. Одновременно с этим для определения маркера высокой остаточной агрегации тромбоцитовна фоне антиагрегантной терапии, которая может иметь прогностическое значение для оценки эффективности конкретного антиагреганта, необходимы и дальнейшие фармакогенетические исследования.