Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики

Автор: Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М., Тагиров М.Ш.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Статья в выпуске: 4 т.208, 2011 года.

Бесплатный доступ

В результате филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env-гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах РТ, относятся к 4-му генотипу BLV. Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип».

Влкрс, типизация, пцр, пдрф, филогенетический анализ

Короткий адрес: https://sciup.org/14287373

IDR: 14287373

Текст научной статьи Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики

Введение. Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [4, 5].

Вопросы диагностики лейкоза крупного рогатого скота в контексте изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма актуальны, учитывая факт невозможности типизации возбудителя серологическими методами исследования (РИД, ИФА) [1, 2, 3, 4, 5].

Ранее предложенные стратегии типизации BLV [1, 2, 3], основанные на интерпретации env -ПЦР-ПДРФ-профилей, также оказались не способными охарактеризовать весь спектр генетического многообразия возбудителя, нежели современный подход оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа env -гена [4, 5].

Основной целью нашего исследования являлась генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан.

Материалы и методы. Исследованию было подвергнуто 70 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 9 районов Республики Татарстан на предмет генотипической идентификации выявленных представителей ВЛКРС на основе ПЦР-ПДРФ- и филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env -гена провируса возбудителя.

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env -гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 3].

Эндонуклеазы рестрикции, используемые для ПЦР-ПДРФ-анализа: BamHI , PvuII, DdeI, SspI, HphI , HaeIII, а также BclI и BglI.

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Секвенирование продуктов амплификации локуса env -гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».

Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355), «N28» (GenBank A/N: HM102356), «N72» (GenBank A/N: JF683619) и «N174» (GenBank A/N: JF713455) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env-гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) с последующим филогенетическим анализом.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env -гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах РТ, относятся к 4-му генотипу BLV (рис. 1).

Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входят изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии [«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N: GU724606)], соответственно (рис. 1).

Следует отметить, что предложенная в 2009 году S.M. Rodriguez et al. [5] система классификации BLV на основе филогенетического анализа env -гена, предусматривает наличие 7 генотипов ВЛКРС, Однако, как в данной [5], так и поздней работе G. Moratorio et al (2010) [4], фактически регламентирующей наличие 7 генотипов, не были проанализированы изоляты охарактеризованного нами нового 8-го генотипа, ввиду депонирования их нуклеотидных последовательностей в базу данных GenBank позже публикаций указанных статей [4, 5].

По результатам анализа внутри- и межгенотипической гетерогенности BLV по env -гену установлено, что исключительно «гетерогенный» критерий оценки генетического разнообразия представителей ВЛКРС в контексте определения их таксономической принадлежности на уровне генотипирования не пригоден из-за отсутствия четкого алгоритма идентификации, так как диапазон значений внутригенотипической гетерогенности, выраженный через %-ое отношение, не разграничивает интервал значений межгенотипической гетерогенности (табл. 1).

В процессе системного анализа рестрикционных картирований локуса env -гена известных представителей BLV, в рамках разработки схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВЛКРС, нами подобраны условия идентификации по 6 эндонуклеазам рестрикции. Обобщенная информация с интерпретацией полученных env -ПЦР-ПДРФ-профилей BLV представлена в табл. 2.

E -2106/FJ3Oe578/genotype 1

---UTuC06II/FM955558/genotype 1

Um.38/FM209471/genotype 1

---AL-63/FJ808571/genotype 1

------Cow:527/AF007764/genntype 1

----------23/U87873/geTi0type 1

---------VdM/M35239/genotype 1

-----------------------------l7uTdistan/EU266062/geTiDtype 1

AL-164/FJ8O8574/genotype 2

------ARGSF8/AF485773/genotype 2

---AL-1453/FJ808577/genotype 2

-------PL-4960/FJ808590/genotype 2

---------JPFU/EFOeseSO/genotype 3

------USCA-1/EF065647/genotype 3

---- ^t 10/HM1 ОгЭбб/деп^уре ---------------3/U87872/genotype 4

BG/EFO65638/genotype 4

----- \N72/JF683619/genotype 4|

4-2/HM563781/genotype 4

CRAS-2/EF065636/genotype 5

--CRGC/EFO65639/genotype 5

-----CRLC— 1/EF065655/genotype 5

----------PL- 1238/FJ808582/genotype 6

----- 151 /AY185360/genotype 6

( 1/AY515280/genotype 7

-------14/AY515274/genotype 7

--------- ^728/™102356/genatyp e

-- ------------------------------30/DQ05941 7/genotype 7

----------------------I2/S8353O/genotype 7

---3-43/HM56376 7/genotype 8

---4-l/HM563766/genotype 8

------M1 /CU724606/genotype 8

------------- ^f174/JF713455/genotype 8|

Рис. 1. Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV ( env -ген)

Табл. 1. Внутри- и межгенотипическая гетерогенность BLV по env -гену

ГЕНОТИП	1-й	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й	7-й	8-й
1-й	0-5%	2-6%	3-6%	2-7%	4-7%	2-6%	3-7%	2-5%
2-й	2-6%	0-2%	3-4%	2-5%	3-5%	3-4%	3-5%	2-4%
3-й	3-6%	3-4%	0-2%	3-5%	4-6%	3-4%	3-5%	3-4%
4-й	2-7%	2-5%	3-5%	0-4%	3-5%	2-5%	3-6%	2-4%
5-й	4-7%	3-5%	4-6%	3-5%	0-3%	4-5%	4-6%	4-5%
6-й	2-6%	3-4%	3-4%	2-5%	4-5%	0-2%	3-5%	2-3%
7-й	3-7%	3-5%	3-5%	3-6%	4-6%	3-5%	0-4%	3-5%
8-й	2-5%	2-4%	3-4%	2-4%	4-5%	2-3%	3-5%	0-2%

Табл. 2. Env -ПЦР-ПДРФ-профили BLV (праймеры env5099-env5521)

Г	Типовой изолят	GenBank A/N	ПЦР-продукт (п.н.)	ПДРФ-фрагменты (п.н.)						К	N
Г	Типовой изолят	GenBank A/N	ПЦР-продукт (п.н.)	BamHI	PvuII	DdeI	SspI	HphI	HaeIII	К	N
1-й	AL-63	FJ808571	444	316/128	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	1	48
1-й	Cow 527	AF007764	444	316/128	444	444	399/45	224/220	285/94/32/27/6	2	8
1-й	23	U87873	444	316/128	444	444	399/45	224/220	312/94/32/6	3	1
1-й	AL-2106	FJ808578	444	444	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	4	36
1-й	UruC06II	FM955558	444	444	444	444	399/45	224/220	285/94/32/27/6	5	1
1-й	Uru38	FM209471	444	444	444	330/114	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	6	3
1-й	VdM	M35239	444	316/128	444	444	399/45	224/181/39	198/94/87/32/27/6	7	1
1-й	Kurdistan	EU266062	444	316/128	444	444	399/45	220/196/28	198/119/94/27/6	8	1
2-й	AL-164	FJ808574	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	9	34
2-й	PL-4960	FJ808590	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/220	198/87/49/45/32/27/6	10	1
2-й	ARGSF8	AF485773	444	316/128	280/164	276/168	399/45	444	198/94/87/32/27/6	11	1
2-й	AL-1453	FJ808577	444	316/128	280/164	276/168	444	224/220	198/94/87/32/27/6	12	1
3-й	JPFU	EF065650	444	316/128	444	276/168	399/45	444	285/94/32/27/6	13	3
3-й	USCA-1	EF065647	444	316/128	444	276/168	399/45	444	285/94/32/21/6/6	14	1
4-й	N72	JF683619	444	444	280/164	276/168	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	15	24
4-й	N10	HM102355	444	444	280/164	168/162/114	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	16	1
4-й	3	U87872	444	444	444	168/162/114	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	17	1
5-й	CRAS-2	EF065636	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/181/39	198/94/87/32/27/6	18	7
5-й	CRGC	EF065639	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/181/39	285/94/32/27/6	19	1
5-й	CRLC-1	EF065655	444	316/128	280/164	276/168	444	224/181/39	198/94/87/32/27/6	20	2
6-й	PL-1238	FJ808582	444	316/128	444	276/168	399/45	224/220	285/94/32/27/6	21	3
6-й	151	AY185360	444	316/128	444	276/168	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	22	7
7-й	N28	HM102356	444	316/128	444	276/168	444	224/137/83	198/94/87/32/27/6	23	17
7-й	I2	S83530	444	316/128	444	276/168	444	224/220	285/94/32/27/6	24	1
7-й	14	AY515274	444	316/128	444	276/168	444	145/137/83/79	198/94/87/32/27/6	25	1
7-й	30	DQ059417	444	316/128	444	276/168	444	444	198/87/49/45/32/27/6	26	1
8-й	N174	JF713455	444	316/128	444	276/168	399/45	224/220	225/94/87/32/6	27	4

Обозначения: Г – генотип; К – комбинация; N – количество известных изолятов BLV с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей, чьи нуклеотидные последовательности локуса env-гена депонированы в базу данных GenBank (по состоянию на апрель 2011 г).

Табл. 3. Идентификационная оценка BLV-позитивных проб в зависимости от выбранной стратегии типизации

Район Республики Татарстан

Исследовано проб

ГЕНОТИП

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

7-й

8-й

К15

К16

К23

К27

Арский

Дрожжановский

Кайбицкий

Лениногорский

Мензелинский

Муслюмовский

Рыбнослободский

Спасский

Чистопольский

ИТОГО

ТИПИЗАЦИЯ

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ

ГЕНОТИП

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

7-й

8-й

К15

К16

К23

К27

3 5 ё

^ G

O' c

c G

H T

^ —

О c

Бельгийский

Австралийский

Японский

H „

G "

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

P 21

В результате применения разработанной нами схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС, согласующейся с филогенетической классификацией, установлено, что из 70 проанализированных BLV-позитивных проб 42 выделенных образца ДНК провируса возбудителя идентифицированы как 4-й генотип ВЛКРС, 27 образцов относятся к 7-му генотипу, а 1 образец изолята «N174» характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа, обозначенного нами «8-й генотип» BLV (табл. 3). Исследованные образцы ДНК провируса ВЛКРС также были проанализированы и с помощью предложенных ранее способов типизации представителей BLV, основанных на ПЦР-ПДРФ-анализе [1 2, 3], но не согласующихся с новым подходом оценки генотипического разнообразия ВЛКРС, основанным на филогенетическом анализе env-гена [4, 5] (табл. 3).

ЛИТЕРАТУРА. 1. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr – 2001. – V. 114. – № 7-8. – P. 252-256. 2 . Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology –1997. – V. 237. – № 2. – P. 261-269. 3. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. González, H. Sentsui // Virus Res. – 2002. – V. 86. – № 1-2. – P. 101-110. 4 . Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. – 2010. – V. 155. – № 4. – P. 481-489. 5 . Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. – 2009. – V. 90. – № 11. – P. 2788-2797.

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВЛКРС, ВЫЯВЛЕННЫХ В ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М., Тагиров М.Ш.

Резюме

GENOTYPIC IDENTIFICATION OF BLV ISOLATES DETECTED IN LIVESTOCK FARMS OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN

Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M., Tagirov M.Sh.

Статья научная