Генотипирование первотёлок по локусу гена жирномолочности (DGAT) и их молочная продуктивность

В селекционной работе с молочными породами скота, а в данном случае холмогорской татарстанского типа, всё большее внимание стали уделять не только гену каппа-казеин, но и такому как диацетил-глицерин О-ацетил трансфераза (DGAT). Данный маркер обуславливает кодирование ключевого фермента для синтеза молочного жира. Содержание жира в молоке, также как и содержание в нём белка является важной технологической характеристикой этого продукта.

Ген DGAT был картирован на хромосоме 14 в геноме Bos taurus, как маркер влияющий на качество молока. Анализ последовательности нуклеотидов, позволили идентифицировать последовательность, как структурную область гена Диацил- глицерал-ацетил-трансферазы. Данный фермент вовлечён в биосинтез липидов [4].

Известно, что неконсервативная замена К232А (лизина на аланин) в последовательности этого гена, снижает содержание жира в молоке коров. При этом аллель содержащий лизин в 232 положениях является наиболее желательным, поскольку коровы, несущие этот аллель гена DGAT (КК и КА), производят более жирное молоко, чем гомозиготные коровы с генотипом АА, содержащий аллель, где в 232 положении располагается аланин [5 ].

Таким образом, генетический полиморфизм молочного жира хорошо изучен учёными селекционерами. И благодаря современным методам генетических исследований можно идентифицировать аллельные варианты гена жирномолочности.

С учетом вышеизложенного, целью нашей работы явилось проведение исследований по изучению полиморфизма и определению частоты встречаемости аллельных вариантов по гену DGAT, и корреляция его генотипов с молочной продуктивностью и качественным составом молока.

Материалы и методы. Исследования проводились на образцах ДНК полученных из крови 103 первотелок холмогорской породы татарстанского типа, с целью внедрения их в племенное ядро СХПК им. Ленина Атнинского района. ДНК выделяли из лейкоцитов крови в количестве 100 мкл с использованием набора реагентов «ДНК-сорб-В» (фирма ООО «ИнтерЛабСервис») согласно методике, представленной изготовителем. В предварительных опытах была разработана программа проведения ПЦР, с некоторыми изменениями температурных и временных режимов реакции, что обеспечило оптимальную амплификацию участков гена DGAT. Фрагменты ДНК амплифицировали на программируемом термоциклере MyCycler (Bio-Rad, США) в следующем режиме:

• 1)    «горячий старт»- 3 мин при 95⁰С;

• 2)    35 циклов: денатурация- 30 сек при 95⁰С , отжиг– 1 мин при 49 ⁰С, синтез- 40 сек при 72 ⁰С ;

• 3)    достройка – 5 мин при 72⁰С;

Составленная реакционная смесь для проведения амплификации генов обьемом 20 мкл, содержащая: 10хTag буфер , 10 мМ dNTPs (смесь нуклеотидов), 25 мM MgCl2 , смесь праймеров (50 пМ/мкл каждого), Tag ДНК полимераза (5 ед./мкл), 100 нг геномной ДНК.

Для амплификации фрагмента локуса гена DGAT использовали праймеры: DGAT1 (GCACCATCCTCTTCCTCAAG) и DGAT2 (GGAAGCGCTTTCGGAT G).

После амплификации полученный фрагмент ДНК был подвергнут расщеплению с помощью эндонклеазы рестрикции AcoI, (СибЭнзим (Россия)). Гидролиз проводили на программируемом термоциклере в соответствии с рекомендациями изготовителя, в следующем режиме: инкубация 4 цикла: при 37 0С, 30 мин.; инактивация 1 цикл: при 65 0С , 20 сек.

Визуализация фрагментов, осуществлялась электрофоретическим разделением продуктов рестрикции в 2% геле агарозы, в присутствии 5 мкл 10% бромистого этидия, далее фиксировали и документировали с помощью системы GelDoc (Bio-Rad, США).

Результаты и обсуждения. При амплификации ДНК лейкоцитов крови коров с парой праймеров DGAT1 и DGAT2, были получены специфические фрагменты гена жирномолочности длиной 411 п.н (пар нуклеотидов) (рис.1). После последующего анализа ПДРФ продуктов амплификации распределение животных было следующим: 41,7% первотёлок имели генотип АА, 51,4%- АК и только 6,7% имели желательный генотип КК. Следовательно, среди исследованных животных были обнаружены три генотипа с преобладанием животных гетерозиготных по данному гену (АК) (рис.2) Частота встречаемости аллеля «А» составила - 0,67, а аллеля «К» - 0,33. Это говорит о том, что генетическое равновесие среди данных животных смещено в сторону нежелательного генотипа. Однако наиболее желательный генотип КК, который составлял 6,7% от общего количества первотёлок, соответствовал относительному содержанию их в племенном ядре (7,0%). Количество жира в молоке за 100 дней лактации у этих животных было выше таковой у гетерозигот (АК) и гомозигот по аллелю «К» (на 0,1 – 4%) соответственно. И обратно коррелированна с молочной продуктивностью и содержанием белка. Удой первотёлок с генотипом КК был ниже, чем у животных других генотипов на 155,5 кг (АА-6,7%) и 90,8 кг (АК-4%) соответственно. Выход белка в молоке также был ниже у животных гомозиготных по аллелю «К» относительно других на 4,6% (АА) и 1,3% (АК).(таб.1)

• 1.    Корреляция генотипов гена DGAT с молочной продуктивностью и качественным составом молока

  Генотип	Количество животных		Удой за 100 дн лактации	Выход
  				молочного белка, кг	молочного жира, кг
  	голов	%
  АА	43	41,7	2338,3± 40,1	72,4±1,18	89,5±1,53
  АК	53	51,4	2273,6± 52,2	70,0±2,08	86,8±2,02
  КК	7	6,7	2202,8±98,7	69,1±7,04	90,3±4,91
  КК к АА			-155,5	-3,3	+0,8
  КК к АК			-90,8	-0,9

Таким образом для повышения жирномолочности молока следует поддерживать в стаде необходимое количество животных , несущих в своем геноме аллель К гена DGAT, путем целенаправленного скрещивания коров с желательными генотипами КК и АК с быками- производителями несущих в своем геноме аллель К.

• 1.    Электрофореграмма результата амплификации геномной ДНК коровы с парой праймеров DGAT 1 и DGAT2

  

• 1-    -маркер для проведения электрофоретического анализа (400,850, 1000,1500 п.н.) Fast Ruler (Helikon);

• 2-    Ампликон гена DGAT, соответствующий 411 п.н.

• 2.    Электрофореграмма результатов анализа полиморфизма гена DGAT 13 исследуемых образцов

  

  1-маркер для проведения электрофоретического анализа (100,400,850, 1000,1500 п.н.) Fast Ruler (Helikon);

2-8- генотипы АК фрагменты которых соответствуют 203-208 п.н,

411 п.н

ЛИТЕРАТУРА: 1. Калашникова, Л.А. ДНК–технологии оценки сельскохозяйственных животных/ Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко [и др]. –М.: ВНИИплем, Лесные поляны.-1999.- 148 с. 2. Моисеева, И.Г. Генофонды сельскохозяйственных животных/ И.Г. Моисеева, С.В. Уханов, Ю.А. Столповский, Г.Е. Сулимова, С.Н. Каштанов. –М.: Наука, 2006. -467с. 3. Gravert H.O. Genomanalyse und Michgualitat // Schriftenr. D. Agrarwiss. Fakultat der Univ. Kiel. - 1990. - B.72. - S. 147-154. 4. Locarte G.A., Machado M.A., Martinez M.L. et. All DGAT1 K 232A polymorphism in Brazilian cattle breeds // Genetics and Molecular Research.- 5(3)- 2006.- P. 475482. 5. Thalle, G., W. Kramer, A. Winter. B. Kaupe, G. Erhardt, and R. Fries. 2003. Effects of DGAT1 variants on milk production traits in German cattle breeds. J. Dairy Sci 81:1911-1918.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПЕРВОЛЁЛОК ПО ЛОКУСУ ГЕНА ЖИРНОМОЛОЧНОСТИ (DGAT) И ИХ МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ

Зиннатова Ф.Ф., Шакиров Ш.К., Алимов А.М.

Резюме

Определены частоты аллелей и генотипов по локусу гена DGAT используя ПЦР- ПДРФ анализ у коров холмогорской породы татарстанского типа. Установлена корреляция генатипами гена DGAT с молочной продуктивностью и качественным составом молока.

FRESH COWS`GENOTYPING AT BUTTERFATNESS GENE LOCUS (DGAT) AND THEIR MILK PRODUCTIVITY

Zinnatova F.F., Shakirov Sh.K., Alimov A.M.