Генотоксические эффекты в буккальном эпителии горняков, работающих в условиях облучения природными источниками ионизирующего излучения

для человека является радон [12], который может распространяться на значительные расстояния и создавать в рудничной атмосфере высокие концентрации. По данным Научного комитета ООН от 5 до 20% всех онкологических заболеваний связано с воздействием на организм радона. Международное агентство по изучению раковых заболеваний отнесло радон к числу канцерогенов первой группы, поэтому генотоксичность радона широко изучается в разных странах мира [1, 6, 10, 13, 16]. В целом, радон обладает кластогенным, генотоксическим эффектом, индуцирует хромосомные аберрации широкого класса и влияет на полиморфизм генов.

Для выявления генотоксических эффектов ионизирующих источников излучения наиболее широкое распространение получил микроядерный тест, используемый при культивировании клеток периферической крови в условиях цитокинетического блока, что создает уникальную возможность проанализировать весь спектр изменений, характеризующих нестабильность генома [2, 4, 5]. Однако в определенных случаях генотоксические эффекты предпочтительнее изучать на буккальном эпителии, который позволяет при минимальном инвазивном вмешательстве получать информацию о генетических изменениях в клетках человека [9]. Этот метод впервые был предложен в 1983 г. [14] и в настоящее время получил широкое распространение при массовом мониторинге генотоксических эффектов факторов окружающей среды [3, 9], в том числе, при оценке степени генотоксичности производственных токсикантов [8].

Цель исследования: оценка генотоксических и цитотоксических эффектов природных источников ионизирующего излучения, включающих радон и дочерние продукты его распада, на буккальном эпителии горняков, пребывающих под землей в условиях смешанного ионизирующего излучения.

Материал и методы. Материалом исследования служили образцы буккального эпителия горняков, работающих под землей на производстве, связанном с добычей и обогащением лопаритовых руд (Ловозерский р-н, Мурманская обл.) и контрольной группы здоровых испытуемых, проживающих в г. Апатиты Мурманской обл. Группы испытуемых состояли из 10 и 8 курящих мужчин, соответственно, в возрасте от 25 до 40 лет. Лопаритовая руда, наряду с ценными металлами (Ti, Ta, Nb и др.) содержит примеси природных радионуклидов (²³⁸U, ²³²Th, ²²⁶Ra), являющихся источником смешанных видов ионизирующего излучения, заряженные частицы которого оседают на пыли и взвесях, содержащихся в шахтном пространстве, поэтому клетки буккального эпителия являются первым барьером [9], возникающим на пути у канцерогенов, поступающих в организм при дыхании, с водой и с пищей.

Взятие образцов букального эпителия и процедуры приготовления препаратов проводили в соответствии с методикой, описанной в работе [3]. Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа AXIOSTAR PLUS (Karl Zeiss, Германия) (об.15 х ок.40), оснащенного камерой CoolSNAPes (Photometrics) с цифровой системой регистрации и обработки изображения на базе ПЗС камеры с програмным обеспечением (Media Cebernetics, Inc.). Анализ частоты встречаемости клеток с генетическими нарушениями и цитотоксическими эффектами проводили на отдельно лежащих и распластанных клеток с подсчетом не менее 1000 клеток на каждом препарате. Микроядра идентифицировали как хроматиновые округлые тела с гладким непрерывным краем, размером не более 1/3 ядра, лежащих отдельно от основного ядра, не преломляющих свет, с интенсивностью окрашивания и рисунком хроматина, как у основного ядра, и находящихся в одной плоскости с ядром [15]. Кроме того, учитывали двуядерные клетки, ядра с насечкой, кариопик-ноз, кариорексис, кариолизис, фрагментацию и вакуолизацию ядра, нарушения типа ядерных почек и апоптозные тельца. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ STATISTICA 6.

Регистрация смешанных видов ионизирующего излучения (альфа-, бета-, гамма- и нейтронное излучение) проводилась в шахте сотрудниками аккредитованной региональной лаборатории радиационного контроля ИХ-ТРЭМС КНЦ РАН по аттестованным методикам на сертифицированном оборудовании: радиометр-спектрометр МКС-А-03-1Н; радиометр гамма-излучения ДКГ-07Д «Дрозд» ФВКМ.412113.026; аэрозольный альфа-радиометр РАА-20П2 «Поиск»; альфа-радиометр РАА-3-01 «Альфа-АЭРО».

Результаты и обсуждения. Исследования, проведенные в шахте Ловозерского района (п. Ревда) по измерению содержания природных радионуклидов, входящих в ряды 232Th и 238U, 40K, на поверхности рудного тела и в различных шахтных отсеках показали, что, при отсутствии техногенных радионуклидов (137Cs, 90Sr и др.), мощность экспозиционной дозы (МЭД) на поверхности выхода рудного тела достигала 1,9 мкЗв/ч, в то время как гамма-фон и МЭД, измеренные на всем протяжении шахты, находились в пределах 0,5-1,5 мкЗв/ч. Гамма-фон за пределами шахты на производственной площади рудника и в здании управления не превышал 0,2 мкЗв/ч. В воздушном пространстве всех шахтных отсеков было выявлено наличие дочерних продуктов распада 226Ra, 228Ra, 224Ra: радиоактивные газы радон и торон, а также RaА, RaВ и RaС. Кроме того, была обнаружена значительная эманация радиоактивных газов на поверхности рудного тела на основе оценки коэффициента равновесия природных радионуклидов, который находился в диапазоне 0,20-0,75. Для средних концентраций радона значения основных продуктов его распада (RaА и RaС) были равны 2720 Бк/м3 и 3760 Бк/м3, соответственно. Объемная радиоактивность радона (222Ra) и торона (220Ra) в различных местах шахты изменялась в 10-36 раз. Максимальные концентрации радона (до 20000 Бк/м3) были выявлены непосредственно в забое и в плохо вентилируемых местах. Превышение нормативного суммарного значения эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) Rn и Tn в 2-14 раз (НРБ-99/2009, п.5.3.3.) было зарегистрировано во многих участках шахты, величины которых варьировали в зависимости от места отбора проб. Таким образом, можно видеть, что горняки подвергаются хроническому облучению смешанными источниками ионизирующего излучения природного происхождения, генотоксические эффекты которого были изучены на клетках буккального эпителя. При оценке цитогенетических изменений клеток буккального эпителия использовали маркеры, приведенные на рисунке 1.

Рис. 1. Схематическая диаграмма различных типов буккальных клеток и возможные механизмы их возникновения (По N. Holland et. al [9])

Большинство клеток буккального эпителия имеют большую площадь цитоплазмы относительно ядра и клетки имеют скорее полигональную форму, чем сферическую, за исключением базальных клеток. Геномная нестабильность или токсическое воздействие на базальные клетки ведет к хромосомным нарушениям или потери хромосом и формированию микроядер (МЯ). Некоторые клетки с геномными нарушениями могут быть элиминированы посредством апоптоза. Дочерние клетки из базального слоя могут дифференцироваться в «шиповатые клетки», которые, в конечном итоге, дифференцируются в плоские и ороговевшие клетки слизистой поверхности, отслаивающиеся с поверхности ротовой полости. Каждая из этих типов клеток может содержать МЯ, частота встречаемости которых варьирует в широких пределах. Молекулярные механизмы, приводящие к различным событиям клеточной гибели и их взаимоотношения пока не выяснены [9]. На рис. 2 представлены клетки буккального эпителия без видимых нарушений (1), двуядерные клетки (2), клетки с МЯ (3) и с апоптозом (4).

Рис. 2. Различные типы клеток буккального эпителия: 1 – без видимых нарушений, 2 – двуядерные; 3 – с МЯ; 4 – с апоптозоными телами

Таблица. Частоты встречаемости клеток с гено- и цито-токсическими эффектами в контрольной группе и у горняков (%)

Результаты анализа частоты встречаемости клеток с генетическими и цитотоксическими эффектами у горняков и в контрольной группе приведены в таблице. Можно видеть, что число клеток с нормальным ядром в контрольной группе в 2 раза больше, чем в группе горняков (p=0,0002). У горняков в 1,8 раз больше клеток с кариолизисом (p=0,0064), в 12,4 раза больше клеток с кариорексисом (p=0,0107) и в 26,2 раз больше двуядерных клеток.

Оказалось, что встречаемость клеток с микроядрами в контрольной группе и у горняков достоверно не различаются (p=0,3675), а число клеток с апоптозными тельцами в 2 раза выше в контрольной группе, чем у горняков (p=0,0561). При объединении всех типы цитологических и ядерных нарушений, характеризующих гибель клеток по типу некроза или апоптоза, оказалось, что в группе горняков преобладает гибель клеток буккального эпителия по типу некроза (66,9% клеток) по сравнению с контролем, где некротическим изменениям подвергается 35,2% клеток при значимости различий p=0,0001. То есть у горняков в 1,9 раз чаще встречается гибель клеток буккального эпителия по типу некроза. В то же время в контроле гибель клеток по типу апоптоза встречается в 1,8 раз чаще, чем в группе горняков. Частота встречаемости клеток с признаками апоптоза в контрольной группе составляет 5,9% против 3,3% в группе горняков (p=0,0771) (рис. 2).

Рис. 2. Сравнительное распределение клеток буккального эпителия без видимых нарушений (1, 2), лизированных (3, 4) и с признаками апоптоза (5, 6) в контрольной группе (светлые столбцы) и у горняков (темные столбцы)

Выводы: мы показали, что в буккальном эпителии горняков генотоксические эффекты, вызванные облучением смешанных источников ионизирующего излучения природного происхождения проявляются в существенном снижении частоты встречаемости клеток без видимых нарушений, возрастании числа клеток с некротическими изменениями и в возрастании более, чем на порядок двуядерных клеток по сравнению с контрольной группой. Резкое возрастание двуядерных клеток в группе горняков по сравнению с контрольной группой может свидетельствовать о воздействии ионизирующей радиации на процесс цитокинеза, нарушение которого может приводить к появлению многоядерных клеток. В исследованиях на клеточных культурах было показано, что при возрастании интенсивности нейтронной компоненты у поверхности Земли в результате солнечных протонных событий, число многоядерных клеток в клеточных культурах различного онтогенетического и филогенетического происхождения, возрастало синхронно с возрастанием интенсивности нейтронной компоненты у поверхности Земли [7]. Не исключено, что при облучении горняков смешанными источниками ионизирующего излучения, вклад нейтронной компоненты, образующийся при взаимодействии альфа частиц с молекулами атмосферы, может проявляться в возрастании числа многоядерных клеток в буккальном эпителии горняков. Возрастание частоты встречаемости двуядерных клеток в 26,2 раза в буккальном эпителии горняков и снижение частоты апоптоза в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой свидетельствует о низкой эффективности работы механизма программируемой гибели клеток (апоптоза) у горняков, призванного элиминировать дефектный генетический материал, что служит неблагоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о высокой степени генотоксичности смешанных типов ионизирующего излучения в условиях горно-ркдного производства.

Работа поддержана грантом РФФИ и Администрацией Мурманской области, проект № 10-04-98809-р_север_а.