Гомоцистеин - важный фактор риска сердечнососудистых осложнений у лиц казахской национальности

Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время являются главной причиной смерти. Каждый год они уносят около 15,3 млн жизней. Среди причин смерти преобладают ИБС и инсульт. Несмотря на угрожающую статистику и высокую заболеваемость, следует отметить некоторый прогресс в борьбе с этими болезнями. В значительной степени это связано с выявлением факторов, значительно увеличивающих риск сердечно-сосудистых заболеваний.

Исследование кандидатных генов при изучении заболеваний, имеющих мультифакториаль-ную природу, в том числе артериальной гипертонии (АГ), является актуальным направлением геномной медицины [1]. Одним из генетических маркеров сердечно-сосудистых заболеваний является ген 5,10 - метилен-тетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR). Установлена связь наследственного дефицита MTHFR с нарушением обмена гомоцистеина [2], но результаты работ, посвященных оценке связи полиморфизма гена с развитием сердечно-сосудистых заболеваний, неоднозначны и противоречивы [2-4].

В связи с этим значительный интерес представляет изучение полиморфизма С677Т гена MTHFR у здоровых и больных артериальной гипертонией, проживающих в Казахстане. Кроме того, учитывая значимость гипергомоцисте-инемии в патогенезе атеросклероза и тромбоза, мы проанализировали уровень гомоцистеина (ГЦ) плазмы крови и маркеров повреждения эндотелия сосудов у больных АГ и перенесших ишемический инсульт.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 120 лиц, казахской национальности, поступивших в кардиологическое отделение ННМЦ г. Астаны с диагнозом Артериальная гипертония 2-3 степени, риск 2-4, не состоящие в родстве, 69 больных АГ (57%) перенесли в анамнезе ишемический инсульт. Средний возраст больных составил 47,0±0,7 лет. В исследование не включались пациенты с ИБС, симптоматической артериальной гипертонией, сахарным диабетом, а также с признаками острых или обострением хронических воспалительных или инфекционных заболеваний.

В контрольную группу были включены 80 практически здоровых лиц без клинических проявлений сердечно-сосудистых заболеваний, без отягощенной наследственности по вышеуказанному заболеванию, с нормальными показателям ЭхоКГ, ЭКГ и нагрузочных проб, средний возраст которых составил 42,5±0,9 года.

В исследуемых группах был произведен забор крови из локтевой вены в объеме 5-10 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 100 мкл 0,5М ЭДТА рН 8,0 в качестве антикоагулянта. Собранная таким образом кровь замораживалась и хранилась при -20 °С.

ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол хлороформным методом [5]. Для амплификации необходимого фрагмента гена MTHFR использовали два праймера [7]:

5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’ 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’.

Определение концентрации гомоцистеина в плазме крови проводилось методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) на аппарате «Anthos-2020». Исследование параметров системы гемостаза проводилось в лаборатории генетики с биохимической и иммунологической диагностикой НИИ кардиологии и внутренних болезней М3 РК. Измерение показателей плазменного гемостаза (уровень фибриногена (ФГ), фактора Виллебранда (ФВБ), ингибитора активатора плазминогена - 1 (ИАП-1)) проводили на автоматическом анализаторе «Behring Coagulation Timer» (ВСТ), с использованием реактивов, калибраторов, стандартных и контрольных материалов фирмы «Behring», Германия. Количественное определение СРБ проводилось на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» реактивами фирмы «Roche». Определение ИЛ-6 и ИЛ-10 проводилось методом ИФА. Определение концентрации молекул клеточной адгезии (Е-селек- тина, ICAM-1) проведены методом ИФА на аппарате «Anthos-2020».

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета статистических программ SPSS 11.0. Наблюдаемое распределение генотипов проверяли на соответствие равновесия Харди-Вайнберга. Достоверность анализа частотного распределения аллелей и генотипов полиморфизма гена MTHFR оценивали с помощью критерия х ². Достоверность различий сравниваемых величин оценивали критериями Стьюдента и достоверными считали различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В табл. 1 отражены данные сравнительного анализа распределения частоты аллелей и генотипов гена MTHFR у больных и здоровых жителей Казахстана. Достоверность анализа частотного распределения аллелей и генотипов полиморфизма С677Т гена MTHFR оценивали с помощью критерия х ². Как и ожидалось, большинство обследованных были носителями СС генотипа, у оставшихся определены СТ и ТТ генотипы. Лица с генотипом ТТ встречались редко, у всех обследованных превалировал С аллель. У казахов, больных АГ, частота генотипа СС встречалась в 2,3 раза чаще, чем частота генотипа СТ, и в 9,7 раз чаще, чем частота генотипа ТТ (65,0; 28,3 и 6,7%, соответственно). Аллель С (79,2%) встречался в 3,8 раза чаще, чем аллель Т (20,8%).

Среди практически здоровых казахов прослеживается аналогичное частотное распределение генотипов - СС почти в 1,8 раза чаще встречался СТ и в 8 раз чаще ТТ (60,0; 32,5 и 7,5%, соответственно). Аллель С (76,3%) обнаружен в 3,2 раза чаще, чем аллель Т (23,7%). Сравнивали частотное распределение генотипов и аллелей гена MTHFR у больных АГ и практически здоровых казахов (табл. 1). Различия статистически не значимые ( х ²=0,09, р=0,77 и х ²=0,07, р=0,79, соответственно).

Изучение полиморфизма С677Т гена MTHFR у лиц казахской национальности установило отсутствие взаимосвязи данного гена с развитием заболевания. Так, в работе Rodrigues Esparragon F. с соавт. генотип изучался у 223 здоровых доноров и 235 пациентов с артериальной гипертонией [6]. Обнаружена достоверная связь ТТ-генотипа с АГ у мужчин (р=0,022). В то же время в австралийском исследовании S. Heux с соавт., где генотип изучали у 250 больных АГ и у 250 пациентов контрольной

Таблица 1

Генотипы и аллели гена MTHFR у больных АГ и здоровых лиц казахской национальности

Гено- Больные АГ Здоровые Р ТИП п=120 часТ°та’ п=80 % частота, % СС 78 65 48 60 Х2=0,09 Р=0,77 ст 34 28,3 26 32,5 ТТ 8 6,7 6 7,5 Аллели С 190 79,2 122 76,3 Х2=0,07 т 50 20,8 38 23,7 Р=0,79 группы, более часто выявлен мутантный аллель Т при АГ (40%), чем в контрольной группе (34%), однако данные различия недостоверны (р=0,07) [4]. Генотип ТТ в данном исследовании также чаще отмечался при АГ, чем в контроле (14 и 10%, соответственно), однако различия недостоверны (р=0,17). Обнаружено, что С677Т мутация MTHFR обеспечивает умеренное повышение риска АГ на фоне ожирения (р=0,03). В китайской популяции при обследовании 127 больных АГ и 170 пациентов контрольной группы связи генотипа с АГ не обнаружено [7].

Таким образом, полученные нами данные согласуются с теми данными литературы, где указывается на недостоверную связь мутации С677Т гена MTHFR с АГ.

Механизмы влияния гомоцистеина на процесс развития сердечно-сосудистых заболеваний осуществляются по нескольким биохимическим каналам и в значительной степени связаны с эндотелиальной дисфункцией [8]. В связи с этим мы провели анализ средних значений показателей эндотелиального повреждения с различными генотипами (СС, СТ, ТТ) гена MTHFR у лиц казахской национальности (табл. 2).

Анализ маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных АГ, казахов, по генотипам в группах (СС, СТ, ТТ) гена MTHFR (табл. 2) показало, что уровень гомоцистеина с высокой достоверностью различался в сравниваемых группах, причем наибольшим был при генотипе ТТ, что почти в 2 раза выше, чем при генотипе СС, и в 1,5 раза выше гетерозиготного генотипа СТ (14,8±0,55, 19,9±0,9 и 27,8±2,2 мкмоль/л, соответственно, р<0,001). У больных с генотипом, содержащих Т аллель (СТ и ТТ), уровни ИАПГ-1,ФВБ, ICAM были значительно выше в сравнении с пациентами генотипом СС и данное различие статистически значимо (Р<0,05). Показатели Е-селектина при геноти-

Таблица 2

Связь генотипа гена MTHFR с маркерами воспаления и эндотелиального повреждения среди больных АГ

Показатель	СС п=78 (1)	СТ п=34 (2)	ТТ п=8 (3)	Р 1-2	Р 2-3	Р 1-3
Гомоцистеин, мкмоль/л	12,8 ± 0,55	19,9 ± 0,9	27,8 ± 2,2	< 0,001	< 0,001	< 0,001
ИАПГ-1, ммоль/л	5,12 ± 0,41	7,30 ± 0,62	8,15 ± 0,95	< 0,05	> 0,05	< 0,05
ФВБ, %	145,5 ± 4,5	165,4 ± 9,3	194,4 ± 6,7	< 0,05	> 0,05	< 0,05
ICAM, нг/мл	350,8 ± 4,8	368,8 ± 11,2	383,4 ± 5,7	< 0,05	> 0,05	< 0,05
Е-селектин, нг/мл	57,5 ± 3,4	63,2 ± 4,29	71,2 ± 8,8	> 0,05	> 0,05	< 0,05
ИЛ-6, пг/мл	51,8 ± 2,5	65,3 ± 6,7	67,6 ± 10,2	< 0,05	> 0,05	< 0,05
ИЛ-10, пг/мл	100,5 ± 5,9	53,6 ± 7,8	41,4 ± 5,9	< 0,05	> 0,05	< 0,001
вчСРБ, мг/дл	13,2 ± 1,6	15,7 ± 1,5	14,2 ± 1,1	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Фибриноген, г/л	3,40 ± 0,16	4,05 ± 0,19	5,23 ± 0,14	< 0,05	< 0,05	< 0,001

Р1-2 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СС и СТ, Р23 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СТ и ТТ, Р1-3 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СС и ТТ пе ТТ значительно больше в сравнении с генотипами СС и СТ (57,5±3,4, 63,2±4,29 и 71,2±8,8 нг/мл соответственно, p<0,05).

При сопоставлении маркеров воспаления больных АГ в зависимости от полиморфизма гена MTHFR установлено, что у казахов с генотипом ТТ показатели ИЛ-6 были достоверно повышены по сравнению с гомозиготами СС (51,8±2,5 пг/мл) и гетерозиготами СТ (65,3±6,7 пг/мл) и составляли 67,6±10,2 пг/мл, p<0,05. Аналогичная закономерность обнаружена и для фибриногена: наибольшие показатели обнаружены при генотипе ТТ (5,23±0,14 г/л), наименьшие - при СС (3,40±0,16 г/л) и средние - при СТ генотипе (4,05±0,19 г/л). Уровень противовоспалительного маркера ИЛ-10 был наибольшим при гомозиготном генотипе по С аллели (СС - 100,5±5,9 пг/мл), средняя - СТ генотипе (53,6±7,8 пг/мл) и наименьшая при ТТ генотипе (41,4±5,9 пг/мл, р<0,001). В отношении уровней вчСРБ у казахов генотипы, содержащие Т аллели (СТ, ТТ), имели тенденцию к более высоким уровням в сравнении с гомозиготами по С аллели (СС), но различия статистически незначимы.

В нашем исследовании наибольшие значения гомоцистеина наблюдались у больных с ТТ генотипом гена MTHFR, наименьший уровень гомоцистеина, находившийся в пределах нормы, был определен у лиц с генотипом СС, гетерозиготы (СТ) занимали промежуточное по ложение. Такая взаимосвязь между генотипом гена MTHFR и уровнем гомоцистеина объясняется снижением активности фермента при мутации - замене цитозина и тимина в положении 677 - приводит к нарушению термолабильности фермента, нарушению метаболизма гомоцистеина, в результате чего он накапливается в плазме [2]. Данная закономерность проявляется в различных европейских популяциях [10]. Взаимосвязь между повышением уровня гомоцистеина и гена MTHFR с АГ изучено в ряде исследований [4, 6, 7, 9]. Группой ученых из Японии было показано, что у пациентов из японской популяции с повторными инфарктами миокарда частота мутантного аллеля Т (0,56) была значительно связана с заболеванием, и генотип ТТ коррелировал с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме [2,13]. Нами был проведен однофакторный анализ связи гена MTHFR с перенесенным в анамнезе ишемическим инсультом (табл. 3).

У пациентов с отсутствием связи с ОНМК чаще встречается генотип СС и аллель С677. Мутантный генотип ТТ встречается исключительно у пациентов с перенесенным ОНМК и соответственно мутантная аллель 677Т в 2,5 раза чаще встречается в данной группе, различия статистически значимые ( х ²=7,01, p=0,03 и х ²=8,8, p=0,003 соответственно).

У больных АГ казахской национальности носительство мутантной аллели 677Т и генотипа

ТТ ведет к риску развития инсульта. Аналогичные данные получены О.В. Сироткиной (2003), у мужчин русской популяции развитие ишемического инсульта возрастает при носительстве аллели 677Т гена MTHFR [15]. У жителей Китая получены данные о взаимосвязи С677Т гена MTHFR с риском инсульта [7]. А вот U. Nowak-Gottl с соавт. отмечают высокую частоту ТТ генотипа гена MTHFR в случае спонтанного ишемического инсульта у детей [12].

Мы показали статистически значимое накопление частоты Т677 аллели гена MTHFR у больных АГ, перенесших инсульт по сравнению с лицами без инсульта. J.C. Chembers с соавт. (2000) показали, что даже небольшое увеличение гомоцистеина, в пределах нормальных физиологических колебаний, индуцирует дисфункцию эндотелия сосудов [11]. В артериальном тромбозе роль пускового фактора играет повреждение эндотелия. Одним из агентов, индуцирующих повреждение стенки сосуда, является гомоцистеин [3, 7, 13]. Показано, что умеренная гипергомоцистеинемия является независимым фактором риска развития церебрального инфаркта и церебрального атеросклероза [14].

Доказано, что возникновение мутации происходит в разных популяциях и аллельном окружении неоднократно, что приводит к повышенной предрасположенности к развитию заболевания [13,15]. Также проведено сравнительное изучение распределения генотипов и аллелей гена MTHFR у казахов в зависимости от отягощенной наследственности по АГ (табл. 4). При этом обнаружено, что при отягощенной наследственности частота встречаемости генотипа СС в 1,5 раза реже в сравнении с неотягощенной наследственностью. Генотип ТТ встречается исключительно у больных с отягощенной наследственностью. Разница статистически достоверна ( Х ²=8,03, p=0,018). При этом мутантный аллель 677Т в 3,5 раза чаще встречается среди больных с отягощенной наследственностью в сравнении с неотягощенной (26,9 и 7,5%, соответственно), различия статистически значимые ( Х ²=9,5, P=0,002).

Полученные данные свидетельствуют о том, что полиморфизм гена MTHFR ассоциируется с отягощенной наследственностью по артериальной гипертонии у казахов. Это откроет широкие перспективы в выявлении генетической предрасположенности к АГ и даст возможность обоснованно и целенаправленно подходить к профилактике заболевания.

Таблица 3

Однофакторный анализ связи гена MTHFR с ишемическим инсультом

Генотипы -	Нет связи с ОНМК		Есть связь с ОНМК		х 2,р
	п	%	п	%
СС	40	54,1%	34	45,9%	Х 2=7,01
ст	12	35,3%	22	64,7%
					Р=0,03
ТТ	0	0	8	100%
Аллели
С	92	88,5%	90	70,3%	Х 2=8,8
т	12	11,5%	38	29,7%	Р=0,003

Таблица 4

Генотипы и аллели гена MTHFR у казахов в зависимости от отягощенной наследственности по АГ

Гено-	Наследственность				Р
	отягощена		не отягощена
типы -
	п=80	частота, %	п=40 час;ота, /О		Х 2=8,03
СС	45	56,2	34	85
					Р=0,018
ст	27	33,8	6	15
ТТ	8	10	0	0
Аллели
С	117	73,1	74	92,5	Х 2=9,5
т	43	26,9	6	7,5	Р=0,002

У больных АГ казахской национальности носительство мутантной аллели Т677 и гомозиготного генотипа ТТ гена MTHFR ассоциирует с отягощенной наследственностью по АГ и высокими показателями гомоцистеина в плазме крови. Гипергомоцистеинемия приводит к изменению синтеза окиси азота, повышению атерогенных липидов, нарушению вазоконстрикции и повреждению эндотелия, повышению факторов воспаления и снижению противовоспалительных факторов.

ВЫВОДЫ

• 1.    Распределение генотипов и аллелей полиморфного маркера С(-677)Т гена MTHFR достоверно не отличаются у больных артериальной гипертонией и практически здоровых лиц казахской национальности и совпадают с таковыми в популяции.

• 2.    Мутация С(-677)Т гена MTHFR у больных АГ казахов не увеличивает риск развития артериальной гипертонии, но ассоциируется с отягощенной наследственностью по АГ и гипергомоцисте-инемией и повышением маркеров повреждения эндотелия сосудов.

• 3.    Полиморфизм С(-677)Т гена MTHFR у больных АГ является генетическим маркером риска развития ишемического инсульта у лиц с отягощенной наследственностью казахской национальности.

Êàðäèîëîãèÿ