Грамин и его токсикологическая оценка

Одной из проблем, существующих в животноводстве, является борьба с иммунодефицитами, в особенности среди молодняка сельскохозяйственных животных. В связи с этим разработка препаратов – стимуляторов иммунорезистентности приобретает актуальное значение. Особый интерес вызывают препараты, получаемые из естественных источников. К таким относятся биоинфузин, гистоген, пробиотические комплексы и фитокомплексы широкого спектра действия на организм животных [1, 3, 5, 7, 8, 10]. Одним из методов борьбы, направленных на создание специфического иммунитета, являются массовые вакцинации. Однако, наряду с формированием иммунного ответа, у животных часто отмечают появление стрессовых реакций. Стресс запускает в организме ряд негативных процессов, влияющих на продуктивность и формирование обшей резистентности [2].

Препарат грамин был создан в лаборатории ветбиотехнологии ФГБНУ ФАНЦ Северо-Востока, города Киров, для коррекции неспецифической резистентно- сти организма животных, в том числе, и при введении вакцин [патент РФ № 2100028 от 27.12.1997]. Основой для создания препарата грамин послужил мик-ромицет Drechslera (D) graminea. Гриб относится к фитопатогенам ячменя, вызывая у последнего полосатую пятнистость листьев. В процессе разработки грамина был установлен биостимулирующий эффект метаболитов D. graminea на организм теплокровных животных [3]. Проявление биостимулирующих свойств у D.graminea отмечались после многократных пересевов выделенного штамма гриба на питательных средах. Одним из главных требований, при создании препаратов различной направленности, является изучение параметров их токсичности для лабораторных животных [6, 11].

Цель настоящих исследований заключалась в изучении острой и субхронической токсичности препарата грамин на белых мышах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: наработать препарат грамин в лабораторных условиях; определить пара- метры токсического действия грамина на белых мышах в остром и субхроническом опытах при парентеральном введении; определить летальные дозы (ЛД50 и ЛД100), рассчитать коэффициент кумуляции грамина.

Материал и методы исследований. Работа выполнялась на базе лаборатории ветбиотехнологии ФГБНУ ФАНЦ Северо-Востока города Киров. Гриб D.graminea выращивали на жидкой среде Чапека в термостате при t = 26-26 °С в течение 30 суток, затем отделяли мицелий от культуральной жидкости для получения целевого продукта. Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей хлороформ – этанол (соотношение 19:5) на пластинах «Силуфол» UV-254 осуществляли идентификацию полученного продукта [«Технические условия на промышленное производство грамина» – ТУ 9337-001-22940614-00]. Опыты по определению острой токсичности препарата грамин проводили на беспородных белых мышах (самцы) массой 19-21 грамм. Препарат вводили животным интрапери- тонеально, однократно в дозах от 4000 до 24000 мг/кг. На каждую дозу использовали по 6 мышей. За состоянием животных наблюдали в течение 14 дней, учитывая при этом число павших животных, клиническую и патологоанатомическую картину отравления. Определяли абсолютно смертельную дозу (ЛД100) и дозу, которая вызывает гибель 50 % животных (ЛД50). ЛД50 вычисляли методом Кербера. Токсиген-ность препарата оценивали в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества, классификация, требования безопасности».

Исследование субхронической токсичности грамина проводили в течение 30 дней, препарат вводили 10 мышам ежедневно внутримышечно. В первые 4 дня эксперимента инъецировали грамин в дозе 0,1 ЛД 50 (133 мг/кг), а затем через каждые 4 дня дозу увеличивали в 1,5 раза и в конечном итоге она составляла 1520 мг/кг. Для определения кумулятивных свойств препарата на белых мышах использовали тест «субхронической токсичности» [12]. Коэффициент кумуляции вычисляли по формуле:

К=

ЛД 5 ⁿ 0

ЛД 50

где К – коэффициент кумуляции; ЛД 50 и ЛД 50ⁿ – средне летальные дозы при однократном и n-суммарном многократном введениях [4].

Результат исследований . Грамин представлял собой прозрачную жидкость светло-коричневого цвета. После дегидратации оставался коричневый осадок 40 мг/мл, хорошо растворимый в 96 градусном этаноле, но слабо растворимый в воде. Идентификация целевого продукта методом ТСХ показала, что показатель Rf (отношение расстояния, пройденного веществом к расстоянию, пройденному растворителем) соответствует 1. Характер флуоресценции, при длине волны 254 nm, желто-голубое пятно. Данный результат подтверждал идентичность полученного продукта препарату грамин.

Опыты по определению летальности мышей после введения грамина пока- зали пороговые дозы его острой токсичности (Таблица 1).

Доза грамина 400 мг/кг вызывала незначительные отклонения в поведении мышей (снижение активности и аппетита), проходящие в течение суток. Летальных случаев не отмечено. Доза 800 мг/кг угнетающе действовала на аппетит и активность животных в течение 2 суток, на 4 сутки пало 1 животное в группе (16,6 %). Доза 1200 мг/кг подавляла активность мышей, аппетит отсутствовал в течение суток. Потребление воды увеличилось, затем клиническое состояние у выживших мышей, постепенно, в течение 5 суток, приходило в норму. Гибель 50 % животных наблюдали на третьи сутки. Доза 1600 мг/кг характеризовалась выраженными признаками острого отравления. Гибель 66,6 % отмечали на вторые сутки, у выживших животных наблюдали сильную депрессию, полное отсутствие аппетита, одышку и озноб. Животные начинали потреблять в больших объемах воду и ограниченно корм на 3 сутки. Полная нормализация поведения выживших мышей отмечалась на 5 сутки.

Гибель мышей от дозы 2000 мг/кг составляла 83,3 %, а от дозы 2400 мг/кг – 100 %. Клиническая картина оказалась одинаковой в данных группах. Летальный исход регистрировали в первые двое суток наблюдений, при этом у половины животных через 2 часа после инъекции отмечалось угнетенное состояние, отказ от корма и воды, отсутствие движений, а через 1-2 суток терминальная фаза и смерть. У выжившей мыши на протяжении 7 дней наблюдали сниженное потребления корма и увеличенное потребления воды, на этом фоне депрессивное состояние, сильное истощение, аллопеция.

Таблица 1 – Влияние грамина на белых мышей в остром опыте (n=6 в группе)

Группа №	Доза (мг/кг)	Летальность животных
		голов	%
1	400	0	0
2	800	1	16,6
3	1200	3	50,0
4	1600	4	66,6
5	2000	5	83,3
6	2400	6	100

Таблица 2 – Масса внутренних органов белых мышей при однократном введении грамина

(n = 6 в группе)

Доза грамина, мг/кг	Масса внутренних органов (г) M ± m
	печень	селезенка	почки
400	1,14 ± 0,02	0,18 ± 0,005	0,14 ± 0,004
800	1,13 ± 0,04	0,19 ± 0,007	0,14 ± 0,005
1200	1,12 ± 0,05	0,19 ± 0,005	0,14 ± 0,004
1600	1,20 ± 0,05*	0,21 ± 0,003	0,15 ± 0,002
2000	1,25 ± 0,03*	0,25 ± 0,01*	0,15 ± 0,006
2400	1,24 ± 0,05*	0,25 ± 0,002*	0,19 ± 0,008*
Контроль(интактные)	1,12 ± 0,02	0,19 ± 0,004	0,14 ± 0,001

Примечание: * - при p < 0,05 в сравнении с контролем

В результате установлено, что среднесмертельная доза (ЛД 50 ) грамина для белых мышей составляет 1334 мг/кг, ЛД 100 – 2400 мг/кг. Таким образом, в соответствии с классификацией параметров токсичности по К.К. Сидорову [9], грамин относится к ряду малотоксичных веществ. Данные о влиянии грамина на массу внутренних органов приведены в таблице 2.

Доза грамина 400 мг/кг приводила к увеличению (p>0,05) по сравнению с контролем печени, с одиночными мелкоточечными кровоизлияниями, остальные внутренние органы оставались без изменений.

Доза 800 мг/кг негативно действо- вала на внутренние органы. При вскрытии отмечали увеличенные в размере и по массе печень, селезенку, почки (p>0,05) с наличием мелкоточечных кровоизлияний.

Доза 1200 мг/кг характеризовалась точечными кровоизлияниями на капсулу печени и почек. Масса исследуемых внутренних органов достоверно не увеличивалась по сравнению с контролем (p>0,05).

Дозы 1600, 2000 и 2400 мг/кг приводили к увеличению массы печени на 711 % в сравнении с контролем (p<0,05). На органе обнаруживали точечные кровоизлияниями под капсулой. Селезенка достоверно (p<0,05) увеличивалась на 31 % при введении грамина в дозах 2000- 2400 мг/кг, а масса почек достоверно (p<0,05) превышала результата в контроле на 35 % после введения грамина в дозе 2400 мг/кг. При исследовании субхронической токсичности грамина, начиная с 5 дня опыта после введения грамина в дозе 450 мг/кг, клиническое состояние мышей ухудшалось, но случаев гибели зафиксировано не было. При этом отмечали взъерошенность шерсти, угнетенное состояние, повышенное потребление воды, резкое снижение двига- тельной активности. Летальность начинали фиксировать после введения доз: 675 мг/кг (10 %); 1013 мг/кг (20 %) и 1520 мг/кг (50 %). У животных наблюдалось сопорозное состояние, отсутствие аппетита, мочеиспускание, дефекация и смерть (Таблица 3).

Расчет коэффициента кумуляции показал, что его величина соответствует 1,14. Данный результат указывал на выраженный кумулятивный эффект грамина.

Таблица 3 – Влияние грамина на летальность мышей в субхроническом опыте (n=10)

Доза грамина, мг/кг	День введения грамина	Летальность животных
		голов	%
133	4	0	0
200	8	0	0
300	12	0	0
450	18	0	0
675	22	1	10
1013	26	2	20
1520	30	5	50

Исследования субхронической токсичности грамина показали, что дозы препарата от 133 до 450 мг/кг не вызывали видимых изменений в клиническом статусе лабораторных мышей, а выраженный токсигенный эффект начинал проявляться с дозы 675 мг/кг и продолжал нарастать после дальнейшего повышения доз грамина (1013-1520мг/кг), вызывая при этом летальность, достигающую уровня 50 %.

Заключение. Установлено, что при интраперитонеальном введении ЛД 50 грамина для белых мышей составляет – 1334 мг/кг, что характеризует препарат как малотоксичный. Коэффициент кумуляции грамина соответствует – 1,13, что относит его к группе препаратов с выраженной кумуляцией.

Резюме

Цель исследований заключалась в изучении острой и субхронической токсичности препарата грамин на белых мышах. Основой для создания препарата грамин послужил мик-ромицет Drechslera graminea. Опыты по определению острой токсичности препарата грамин проводили на беспородных белых мышах (самцы) массой 18-20 граммов. Препарат вводили животным интраперитонеально, однократно в дозах от 400 до 2400 мг/кг. На каждую дозу использовали по 6 мышей. За состоянием животных наблюдали в течение 14 дней. Определяли дозу, вызывающую гибель 50 % животных (ЛД 50 ), и абсолютно смертельную дозу (ЛД 100 ). ЛД 50 вычисляли методом Кербера. Исследование субхронической токсичности грамина проводили в течение 30 дней. Препарат вводили 10 мышам ежедневно внутримышечно, в первые 4 дня инъецировали грамин в дозе 0,1 ЛД 50 , а затем через каждые 4 дня дозу увеличивали в 1,5 раза и в конечном итоге она составляла 1520 мг/кг. Для определения кумулятивных свойств препарата на белых мышах использовали тест «субхронической токсичности». Достоверность полученных результатов учитывалась в соответствии с t-критерием Стьюдента при p<0,05. В результате установлено, что среднесмертельная доза (ЛД 50 ) грамина для белых мышей составляет 1334 мг/кг, ЛД 100 – 2400 мг/кг. Исследования субхронической токсичности грамина показали, что препарат дозы от 133 до 450 мг/кг не вызывает существенных изменений в поведенческих реакциях лабораторных мышей. Выраженный токсигенный эффект начинал проявляться с дозы 675 мг/кг и продолжал нарастать после дальнейшего повышения доз грамина (1013-1520 мг/кг), вызывая при этом летальность, достигающую уровня 50 %. Установлено, что при интраперитонеальном введении ЛД 50 грамина для белых мышей соответствует 1334 мг/кг, что позволяет относить препарат к малотоксичным веществам. Коэффициент кумуляции грамина равен 1,14, что соответствует группе препаратов с выраженной кумуляцией.