GWAS-анализ голштинского крупного рогатого скота Свердловской области с использованием полной и экстремальной выборок

Введение. Интенсивная селекция по признакам молочной продуктивности, усиленная улучшенным кормлением и управлением, а также ускоренная за счет развития репродуктивных технологий и геномной селекции [1], значительно увеличила производство молока за последние годы [2]. Голштинская порода на сегодняшний день доминирует в мировом молочном животноводстве. На многих рынках, включая США, Бразилию, Японию и Европу [3], а также в России [4, 5] основная часть молочной продукции производится именно коровами голштинской породы, которые демонстрируют высокие удои.

В современных условиях для более эффективной селекции необходимы углубленные знания о генетической структуре и взаимодействии генов, влияющих на ключевые экономические признаки, что позволит точно определить вклад каждого гена и оптимизировать селекционные стратегии для улучшения молочной продуктивности, особенно учитывая, что большинство из них являются комплексными и зависят от многих генов и факторов среды.

В этой связи метод GWAS (Genome-Wide Association Study) становится важным инструментом в молочном скотоводстве для выявления генов и генетических маркеров, влияющих на ключевые хозяйственно важные признаки, такие как молочная продуктивность (удой, содержание жира и белка) [6–8], здоровье животных (устойчивость к маститу, инфекционным и метаболическим заболеваниям) [9], фертильность, а также экстерьерные характеристики коров. Благодаря GWAS ученые могут локализовать количественные локусы признаков (QTL) и идентифицировать кандидатные гены, которые оказывают влияние на эти признаки [10].

Полученные с помощью GWAS данные используются для разработки и внедрения систем геномной оценки племенной ценности, что позволяет повысить точность прогнозирования генетического потенциала животных и ускорить генетический прогресс. Применение геномной селекции помогает проводить отбор по ранее недостаточно оцененным или поздно проявляющимся признакам, таким как здоровье и воспроизводственная способность.

Цель исследования – выявление генетических маркеров, ассоциированных с показателями молочной продуктивности (удоем, содержанием жира и белка в молоке) у голштинского крупного рогатого скота, с использованием метода полногеномного ассоциативного анализа (GWAS) на выборке животных из племенных хозяйств Свердловской области за 2018–2024 гг.

Задачи: провести генотипирование выборки коров с использованием ДНК-биочипов и осуществить контроль качества данных; выполнить GWAS-анализ молочной продуктивности на полной популяции и экстремальных фенотипических группах; идентифицировать статистически значимые однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), связанные с удоем, содержанием жира и белка; проанализировать гены, расположенные вблизи значимых онп, для понимания их роли в метаболизме липидов, иммунном ответе и развитии ткани молочной железы; оценить совпадение генетических ассоциаций между полной выборкой и экстремальными группами для подтверждения надежности маркеров.

Объекты и методы. Исследование проводилось на базе трех племенных хозяйств Свердловской области, специализирующихся на разведении молочного скота. Всего в группу исследования было отобрано 539 полновозрастных коров 2018–2024 гг. рождения.

Для геномного анализа у коров отбирали кровь из подхвостовой вены, используя пробирки с ЭДТА (для стабилизации образцов). Далее образцы были отправлены в сторонние лаборатории для выделения ДНК и генотипирования.

Часть крови поступила в ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста), где проводилось генотипирование на ДНК-биочипах GGP Bovine 150K (Neogen, США).

Остальные образцы были направлены в Центр геномной селекции ООО «Мираторг», где использовались Bovine 50K ДНК-биочипы (Illumina, США).

Первичную фильтрацию по GeneScore > 0,35 проводили в программном обеспечении R Foundation for Statistical Computing. Последующие фильтрации по отсутствующим данным генотипов проводили с помощью PLINK v1.9 (Purcell S. и др., 2007) и опций – geno 0,05 – mind 0,05, – maf 0,01.

В первом варианте GWAS-анализа использовали всю доступную популяцию животных за 2018–2024 гг, прошедшую контроль качества по генотипам и фенотипам. Для трех признаков продуктивности (удой, содержание жира, содержание белка в молоке за первую лактацию с поправкой на 305 дней) на полной выборке животных были проведены ассоциативные исследования с помощью линейной регрессии в PLINK – без разделения животных по уровням признаков или выделения экстремальных групп.

Кроме того, был проведен второй вариант полногеномного ассоциативного анализа на основе экстремальной выборки фенотипов [11]. Исходная выборка животных была разделена по каждому признаку – удою молока, содержанию жира и белка – на четыре квартиля, в соответствии с их значениями фенотипов. Разделение выполняли с использованием функции qcut() библиотеки pandas языка Python, которая обеспечивает равное распределение наблюдений по квартилям. Для каждого признака были сформированы две группы, объединяющие животных из крайних квартилей: Q1 (высокие значения признака) и Q4 (низкие значения признака). В дальнейшем были созданы выборки Q1 + Q4 по удою, Q1 + Q4 по содержанию жира в молоке и Q1 + Q4 по содержанию белка в молоке, которые использовались для проведения GWAS-анализа. Для каждой группы дополнительно вычислялись средние значения и стандартные отклонения основных показателей продуктивности (удой, массовая доля жира и белка) и количество включенных животных. В результате для анализа были использованы 3 группы по 270 животных в каждой.

Для выявления ассоциаций между однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП) и количественными признаками был проведен полногеномный ассоциативный анализ с использованием программного пакета PLINK версии 1.9.

Анализ ассоциаций осуществлялся методом линейной регрессии, реализованным в PLINK (–linear), при котором для каждой ОНП-позиции тестировалась зависимость значения признака от количества минорных аллелей.

Для оценки статистической значимости ассоциаций использовали p-value, полученные для каждого маркера, а также применяли поправки на множественное тестирование (например критерий Бонферрони). Результаты визуализировали в виде Манхэттенских графиков с распределением значимых ОНП по хромосомам.

Результаты и их обсуждение . В исследовании молочной продуктивности крупного рогатого скота анализировались три ключевых показателя продуктивности: удой, содержание жира и белка в молоке. Средние показатели продуктивности для анализируемых особей приведены в таблице 1.

Кроме того, для анализа было проведено разделение на квартили по значениям удоя, жира и белка и объединение первого и четвертого квартиля для создания контрастной группы (табл. 2).

Таблица 1

Группа	Значение
Общее	x ± sd
Удой	8437 ± 1285
Жир	3,92 ± 0,12
Белок	3,24 ± 0,11

Таблица 2

Группа	Квартиль	Удой, кг	Жир, %	Белок, %
			x ± sd
Удой, кг	Q1	10028 ± 680	3,93 ± 0,136	3,231 ± 0,109
	Q4	6775 ± 653	3,92 ± 0,123	3,256 ± 0,103
Жир, %	Q1	8643 ± 1315	4,07 ± 0,068	3,254 ± 0,146
	Q4	8582 ± 1238	3,79 ± 0,092	3,191 ± 0,078
Белок, %	Q1	8324 ± 1366	3,998 ± 0,109	3,379 ± 0,066
	Q4	8619 ± 1166	3,92 ± 0,150	3,115 ± 0,045

Средние показатели молочной продуктивности и состава молока проанализированного крупного рогатого скота (n = 539)

Mean milk productivity and composition indicators in analyzed cattle

Средние показатели молочной продуктивности и состава молока по группам крупного рогатого скота (n = 135)

Mean milk productivity and composition indicators by cattle group

Данные таблицы 2 демонстрируют различия в средних значениях и вариабельности ключевых продуктивных признаков – удоя, содержания жира и белка в молоке – между группами животных, отобранных по низким и высоким квартилям каждого из этих признаков.

Для каждой из трех групп, сформированных по квартилям по удою, жиру и белку, наблюдается четкое разделение уровней этих признаков, что подтверждает адекватность квартильного разбиения для выделения подгрупп с разной продуктивностью. В то же время стандартные отклонения показывают вариацию внутри каждой подгруппы, что позволяет оценить однородность или разброс признаков среди животных с низким и высоким уровнем отбора.

В результате проведения полногеномного ассоциативного анализа (GWAS) на выборке крупного рогатого скота были построены три Манхэттенских графика, иллюстрирующих распределение значимости ОНП для трех основных показателей продуктивности: удой, содержание жира и содержание белка в молоке как для всей анализируемой популяции, так и для группы первого и четвертого квартилей (рис. 1, 2).

Сравнительный анализ GWAS, выполненный как на полной выборке животных за 2018–2024 гг., так и на экстремальной подвыборке, сформированной из крайних квартилей фенотипов, выявил высокую степень совпадения обнаруженных генетических ассоциаций. Этот факт подтверждает, что основные маркеры, связанные с продуктивными признаками, обнаруживаются независимо от выбора стратегии отбора животных, будь то полный состав популяции или ее крайние фенотипы. Подобные наблюдения согласуются с ранее опубликованными исследованиями, где анализ крайних фенотипов, известный как метод «extreme phenotype sampling», демонстрирует повышение статистической мощности при идентификации значимых генетических вариантов без потери информации, выявляемой классическим GWAS на всей выборке [12, 13].

-loglO(p-value)                                                                      -loglO(p-value)                                                                      -loglO(p-value)

Рис. 1. Манхэттенские графики распределения ОНП-ассоциаций по хромосомам для всех животных: А – удоя; Б – жира; В – белка

Manhattan plots showing the distribution of SNP associations across chromosomes for all animals: A – milk yield; Б – fat content; В – protein content

Рис. 2. Манхэттенские графики распределения ОНП-ассоциаций по хромосомам для квартилей: А – удоя; Б – жира; В – белка

Manhattan plots showing the distribution of SNP associations across chromosomes for quartiles: A – milk yield; Б – fat content; В – protein content

Единственным ОНП, описанным ранее в научной литературе, оказался ARS-BFGL-BAC-36190 – Генетический маркер на 20-й хромосоме крупного рогатого скота, который был выявлен в исследованиях GWAS как связанный с молочной продуктивностью и ростом животных. Он располагается в области, где находятся важные гены, включая GPX8, CDC20B и GZMA, которые играют роль в регуляции молочного производства и иммунных процессов у коров. Этот ОНП был описан в работе D. Lu et al. [14], где выявлена его значимая ассоциация с признаками роста и кормовой эффективности коров.

В целом в результате анализа было обнаружено двадцать значимых маркеров, локализованных на разных хромосомах; в пределах

250 Мн (мегануклиотидов) справа и слева от ОНП были определены близлежащие гены (табл. 3).

Наиболее выраженное скопление ассоциированных ОНП, выявленное на 14-й хромосоме, охватывает несколько связанных между собой генов, таких как SAMD12, TNFRSF11B, COLEC10, MTBP, MRPL13. В исследованиях SAMD12 и TNFRSF11B показаны как гены, влияющие на мясную продуктивность крупного рогатого скота [15, 16]. Гены COLEC10 и MRPL13 играют роль в метаболических процессах и формировании иммунных реакций [17, 18].

На 20-й хромосоме выделен ОНП в области, включающей гены GPX8, GZMK, GZMA, CDC20B и др., что также может свидетельствовать о комплексном генетическом влиянии на продуктивные признаки – аналогично хорошо изученным регионам у мировых пород скота [19–21].

Ряд ОНП лежат в локусах с генами, отвечающими у млекопитающих за эмбрио- и морфогенез [22, 23], липидный и энергетический обмен [24–26], структурную организацию клеток, иммунный ответ [17, 18, 27–32], тепловой стресс [33–36] и опорно-двигательную систему [23, 37–39].

Отдельно стоит отметить следующие гены: ген SLC27A6 из семейства SLC27, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт жирных кислот, играющий критическую роль в метаболизме липидов, формировании мяса, регуляции метаболических путей в ткани молочных желез и жировой составляющей мяса и молока [40, 41]. COX7A2, DEPTOR, PLPP1 также связаны с молочной продуктивностью и кормовой эффективностью [42–44]. Белок TCN2 транспортирует витамин B 12 и ассоциирован с содержанием транс-кобаламина в молоке [45].

Таблица 3

Significant SNPs identified by GWAS and their nearest genes

ОНП	Хромосома:позиция	Ближайшие гены
1	2	3
BTB-011652481	2: 55372153
BTB-011652381	2: 55405767
BTA-91681-no-rs2	5: 2425567
BTA-94737-no-rs1	6: 2584893	TMA16; TKTL2; NPY5R; NPY1R; NAF1
BTA-20553-no-rs1	7: 26286219	FBN2; ISOC1; ADAMTS19; SLC27A6
ARS-BFGL-NGS-1166901	9: 15110882	COX7A2; COL12A1; TMEM30A; FILIP1; SENP6
BTB-005677141	14: 47542510	MAL2; SAMD12; TNFRSF11B; COLEC10
ARS-BFGL-NGS-296221	14: 47615069
UA-IFASA-91401	14: 47652361
ARS-BFGL-NGS-154241	14: 81878266
ARS-BFGL-NGS-266621	14: 84275325	DEPTOR; MTBP; MRPL13
ARS-BFGL-NGS-207611	17: 69459128	PITPNB
ARS-BFGL-NGS-540341	17: 70962192	GAS2L1; RHBDD3; EWSR1; EMID1; AP1B1; RASL10A; TCN2; CCDC157; OSM; GAL3ST1; DUSP18; MTFP1; NIPSNAP1; TBC1D10A; SF3A1; CASTOR1; ZMAT5; SEC14L3; LIF; MTMR3; OSBP2; SEC14L4; SEC14L2; ASCC2; C17H5orf52; UQCR10; SLC35E4; THOC5; PES1; HORMAD2
ARS-BFGL-BAC-356231	17: 71352459
ARS-BFGL-NGS-417451	18: 43614762	GPATCH1; FAAP24; RGS9BP; NUDT19; CEBPG; SLC7A9; ANKRD27; CEBPA; RHPN2; PDCD5; SLC7A10; PEPD
ARS-BFGL-BAC-361902	20: 24179723	PLPP1; GPX8; MIR449B; GZMK; DHX29; GZMA; SNX18; MTREX; gzmA; ESM1; COX8A; HSPB3; CDC20B

Окончание табл. 3

1	2	3
BTA-52945-no-rs1	21: 7369556	TTC23; SYNM; LRRC28; MEF2A; LYSMD4
BovineHD21000165521	21: 57602687	GOLGA5; TC2N; CPSF2; SLC24A4; NDUFB1; ATXN3; FBLN5; LGMN
Hapmap51532-BTA-1012061	24: 49547605	ACAA2; DYM; RPL17; SMAD7; C24H18orf32
BTA-61940-no-rs1	26: 918433	IPMK; CISD1; UBE2D1

1ОНП, ассоциированные с массовой долей белка (P).

2ОНП, ассоциированные с массовой долей жира (FC).