Характеристика BRCA-ассоциированного эпителиального рака яичников в российской популяции

Рак яичников (РЯ) занимает первое место по смертности среди гинекологических злокачественных заболеваний. В России ежегодно злокачественные опухоли яичников выявляются более чем у 13 000 женщин, а умирают от этого заболевания около 8 000 женщин. У большинства пациенток заболевание выявляется на поздних стадиях, при которых общая пятилетняя выживаемость не превышает 30-40% [1]. В связи с этим проблема ранней диагностики этого рака является актуальной.

Основную роль в развитии РЯ отводят гормональному и генетическому факторам. В связи с генетическим фактором выделяют спорадический (ненаследственный рак), на долю которого приходится 75-85% всех случаев РЯ, и наследственный рак, составляющий 15-25% всех случаев заболевания и характеризующийся наличием клинически значимого генетического варианта в генах, участвующих в процессах репарации, регуляции клеточного цикла, апоптоза, то есть отвечающих за поддержание стабильности генома [2].

Прежде всего, к таким генам относятся гены BRCA1 и BRCA2: 65-85% всех случаев наследственного рака связаны с повреждением этих генов. У женщин с патогенными изменениями в гене BRCA1 вероятность развития заболевания в течение жизни выше на 58%, а у женщин с повреждениями в гене BRCA2 - на 29% [3]. Наследственный BRCA-ассоциированный РЯ характеризуется клиническими особенностями течения заболевания. Для него характерен более молодой возраст манифестации заболевания по сравнению со спорадическим раком. В основном BRCA-позитивный РЯ характеризуется серозным гистологическим типом с высокой степенью злокачественности. Серозная карцинома высокой степени злокачественности составляет 70-75% всех эпителиальных злокачественных опухолей яичников [4-6]. Наличие клинически значимых вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 во многом определяет выбор тактики лечения и профилактических мероприятий [7].

В настоящее время в России в большинстве лабораторий молекулярно-генетическая диагностика для выявления наследственных форм РЯ заключается в определении нескольких патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 , которые наиболее характерны для нашей популяции, с использованием «стандартных» диагностических панелей [8]. Однако ряд проведенных исследований указывает на наличие других клинически значимых вариантов в данных генах, которые также встречаются в нашей популяции и увеличивают онкологический риск, поэтому должны быть учтены при назначении лечения и проведении профилактических мероприятий [9].

Целью работы было исследовать особенности BRCA -ассоциированного эпителиального рака яичников в российской популяции.

Материалы и методы

В обследованную группу вошли 298 пациентов с диагнозом эпителиальный РЯ в возрасте от 19 до 81 года, которые проходили обследование и лечение в Российском научном центре рентгенорадиологии с 2010 по 2022 г. (табл. 1). Все они подписали добровольное информированное согласие на проведение молекулярно-генетического исследования. Также всем пациентам было проведено гистологическое исследование тканей опухоли. Средний возраст манифестации заболевания составил 53 года. У 37% пациентов заболевание развилось в возрасте до 50 лет. Онкологически отягощенный семейный анамнез имели 16% обследованных. Наличие или отсутствие онкологически отягощенного семейного анамнеза оценивалось по следующим критериям. Считалось, что пациент имеет онкологически отягощенный семейный анамнез, если: 1) у него имелся хотя бы один кровный родственник первой, второй или третьей степени родства с диагнозом: рак молочной железы (РМЖ), установленном в возрасте до 50 лет или диагноз РЯ, РМЖ у мужчин, рак поджелудочной железы или метастатический рак предстательной железы, установленный в любом возрасте; 2) пациент имел хотя бы двух родственников первой, второй или третьей степени родства с диагнозом РМЖ, установленном в любом возрасте. У 21% пациентов были выявлены первично-множественные злокачественные новообразования (ПМЗН) (РЯ и РМЖ или рак эндометрия (РЭ) или колоректальный рак (КР)). У большей части больных РЯ (82%) заболевание было диагностировано на поздней стадии (3-4 стадии заболевания).

Табл. 1. Клиническая характеристика обследованной группы больных РЯ

Характеристика	Больные раком яичников (n=298)
1. Возраст
Средний возраст манифестации заболевания, лет	53 (19-81)
до 50 лет, чел. (%)	110 (37)
51 год и старше, чел. (%)	188 (63)
2.Семейный онкологический анамнез
Отягощен, чел. (%)	48 (16)
Не отягощен, чел. (%)	250 (84)
3. Диагноз

Первично-множественные злокачественные новообразования (рак яичников + рак молочной железы, рак яичников + рак эндометрия, рак яичников + колоректальный рак), чел. (%)	64 (21)
Рак яичников, чел. (%)	234 (79)
4. Гистологический тип опухоли
Серозная карцинома высокой степени злокачественности, чел. (%)	238 (80)
Серозная карцинома низкой степени злокачественности, чел. (%)	12 (4)
Эндометриоидная карцинома, чел. (%)	18 (6)
Муцинозная карцинома, чел. (%)	9 (3)
Светлоклеточная карцинома, чел. (%)	21 (7)
5. Стадия
1-2, чел. (%)	54 (18)
3-4, чел. (%)	244 (82)

Что касается гистологического типа опухоли, у 80% пациентов была диагностирована серозная карцинома высокой степени злокачественности, у 7% пациентов - светлоклеточная карцинома, у 6% пациентов - эндометриоидная карцинома, у 4% пациентов - серозная карцинома низкой степени злокачественности, у 3% пациентов - муцинозная карцинома (табл. 1).

На первом этапе обследования всем пациентам проводилось ДНК-тестирование на наличие распространенных в российской популяции наследственных патогенных вариантов в генах BRCA1/2 методом ПЦР в реальном времени.

Для выделения ДНК использовали наборы «М-Сорб» («Синтол», Россия). Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием панели реагентов «ОнкоГенетика BRCA» («ДНК-Технология», Россия), которая содержит специфические праймеры для определения 7 вариантов в гене BRCA1 (185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G, 2080delA) и 1 варианта в гене BRCA2 (6174delT).

При отсутствии у пациентов этих патогенных вариантов проводилось исследование методом секвенирования нового поколения (NGS) , которое позволяло исследовать всю кодирующую часть и регионы сплайсинга генов BRCA1/2 . Данным методом были обследованы 93 больных эпителиальным РЯ.

Геномную ДНК для исследования выделяли из периферической крови с использованием реактивов «QIAamp DNA Blood Mini Kit» (Qiagen; Германия) по протоколу производителя. Рабочая концентрация ДНК составляла не менее 10 нг/мкл. Подготовку библиотек для секвенирования проводили по протоколу фирмы-производителя с использованием методики селективного захвата участков ДНК, кодирующих регионы исследуемых генов, с помощью панели «TruSight Cancer» (Illumina; США) и набора реагентов «TruSight Rapid Capture» (Illumina; США).

Секвенирование подготовленных библиотек проводили на приборе «MiSeq» (Illumina; США) с использованием наборов реагентов «MiSeq Reagent Kits v2» (Illumina; США) методом парно-концевого чтения (2 × 151 пар оснований). Среднее покрытие исследуемых таргетных участков ДНК составило не менее 100×.

Выравнивание прочитанных последовательностей относительно референсной последовательности генома человека (hg19), а также фильтрация их по качеству, проводилось в автоматическом режиме с помощью программы Local Run Manager (Illumina, США).

Для анализа (аннотации) генетических изменений использовалась программа Variant Studio 3.0 (Illumina, США). Для визуализации геномных данных: оценки глубины прочтения и выявления возможных ложноположительных результатов использовалась программа Integrative Genomics Viewer (IGV) (Broad Institute, USA). Для оценки популяционных частот аннотированных генетических вариантов использовались данные базы gnomAD ExomesVersion: 2.1.1 (Genome aggregation database). Клиническую значимость выявленных генетических нарушений оценивали на основании критериев оценки «патогенности»

генетических вариантов, предложенной Американским колледжем медицинской генетики (ACMG) [10], с использованием баз данных «dbSNP» («The Single Nucleotide Polymorphism database»), «ClinVar» («Clinical Variation»), «HGMD» («Human Gene Mutation Database»), клинически сертифицированной платформы VarSome, а также данных публикаций. Генетические варианты, не имеющие клинического значения, а также имеющие неизвестное клиническое значение, в данной работе не рассматривали.

Для верификации выявленных изменений нуклеотидной последовательности использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Анализ проводили на автоматическом капиллярном секвенаторе «ABI PRISM 3100» (Applied Biosystems; США).

Результаты

В результате проведенного исследования у 48 из 298 (16%) больных эпителиальным РЯ выявлены наиболее распространенные в российской популяции наследственные варианты в генах BRCA1 и BRCA2 , определяемые с помощью «стандартных» диагностических панелей (табл. 2). В спектре выявленных изменений преобладал вариант 5382insC в гене BRCA1 . Его частота в группе обследованных составила 10,7%. Доля данного варианта среди выявленных изменений составила 67% (рис. 1). Частота остальных генетических вариантов была, по крайней мере, на порядок ниже.

Табл. 2. Частота встречаемости наиболее распространенных в популяции патогенных генетических вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 у больных эпителиальным РЯ

Ген	Название   мутации (номенклатура BIC)	Число пациентов с мутацией в обследованной группе, чел.	Частота %	мутации,
BRCA1	5382insC	32	10,7
BRCA1	4153delA	2	0,7
BRCA1	300T>G	2	0,7
BRCA1	2080delA	2	0,7
BRCA1	185delAG	1	0,3
BRCA1	3819delGTAAA	6	2,0
BRCA1	3875delGTCT	-	-
BRCA2	6174delT	3	1,0
Всего		48	16,1

2080deL4 4%

300TXR;

4% .

6174delT;

6%

ISSdelAG: 2%. ,

3819delGT

AAA;

13%

5382insC;

67%

4153delA;

4%

Рис. 1. Доля каждого из наиболее распространенных в популяции патогенных генетических вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 у больных эпителиальным РЯ в спектре выявленных изменений

Анализ всей кодирующей области, а также регионов сплайсинга генов BRCA1 и BRCA2 методом высокопроизводительного секвенирования позволил выявить у 15 из 93 (16%) пациентов 13 патогенных вариантов: 6 - в гене BRCA1 и 7 - в гене BRCA2 . Варианты в гене BRCA1 представлены тремя нонсенс- мутациями, двумя делециями со сдвигом рамки считывания и одним нарушением в сайте сплайсинга. В гене BRCA2 патогенные варианты представляли собой шесть вариантов со сдвигом рамки считывания и одну нонсенс-мутацию (табл. 3).

Табл. 3. Характеристика и частота редких патогенных вариантов нуклеотидной последовательности в генах BRCA1 и BRCA2 в группе больных эпителиальным РЯ

Ген	Название генетического варианта (номенклатура HGVS)	Идентификационный номер (dbSNP)	Характеристика варианта	Число больных, чел.
BRCA1	c.4165_4166delAG (p.Ser1389Terfs)	rs80357572	делеция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA1	c.2158G>T (p.Glu720Ter)	rs80356875	нонсенс-мутация	1
BRCA1	c.5152+1G>T	rs80358094	мутация в сайте сплайсинга	1
BRCA1	c.1510delC (p.Arg504Valfs)	rs80357908	делеция со сдвигом рамки считывания	3
BRCA1	c.5314C>T (p.Arg1772Ter)	rs80357123	нонсенс-мутация	1
BRCA1	c.3964A>T (p.Lys1322Ter)	rs80357343	нонсенс-мутация	1
BRCA2	c.5718_5719delCT (p.Leu1908Argfs)	rs80359530	делеция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA2	c.8208_8209insAG (p.Leu2737Serfs*2)	rs483353122	инсерция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA2	c.3880_3883delTTAC (p.Leu1294LysfsTer6)	-	делеция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA2	c.5237_5238insT (p.Asn1747Ter)	rs80359499	инсерция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA2	c.5855delT (p.Leu1952TrpfsTer11)	-	делеция со сдвигом рамки считывания	1
BRCA2	c.1796_1800delCTTAT (p.Ser599Ter)	rs276174813	делеция со сдвигом рамки считывания	1

BRCA2 c.3881T>A rs80358632 нонсенс-мутация 1 (p.Leu1294Ter)

Все варианты были выявлены по одному, кроме генетического варианта с.1510delC в гене BRCA1 , обнаруженного у трех пациентов.

Частота встречаемости клинически значимых генетических вариантов, выявленных методом высокопроизводительного секвенирования, сопоставима с частотой «стандартных» патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 (статистически значимые различия не обнаружены, p >0,05), за исключением изменения нуклеотидной последовательности 5382insC в гене BRCA1 . Таким образом, метод NGS позволил дополнительно к 16% больных РЯ, имеющих распространенные в популяции патогенные варианты в генах BRCA1/2 , выявить 16% пациентов с патогенными вариантами в других регионах данных генов.

Сравнение групп пациентов с выявленными повреждениями в генах BRCA1 и BRCA2 показало, что в группе пациентов с выявленными патогенными вариантами как в гене BRCA1 , так и в гене BRCA2 средний возраст манифестации заболевания оказался ниже, чем в общей группе. Однако в группе пациентов - носителей повреждений в гене BRCA1 он был ниже (47 лет), чем в группе пациентов с изменением нуклеотидной последовательности в гене BRCA2 (52 года). При этом заболевание развилось в возрасте до 50 лет у 64% пациентов с выявленными патогенными вариантами в гене BRCA1 и только у 30% больных с повреждением в гене BRCA2 . 75% пациентов-носителей патогенных вариантов в гене BRCA1 и 70% пациентов с повреждением в гене BRCA2 имели онкологически отягощенный семейный анамнез. Примерно у половины пациентов с выявленными патогенными вариантами как в гене BRCA1 , так и в гене BRCA2 диагностировали ПМЗН. Таким образом, клиническими признаками наследственного рака, которые включают: молодой возраст манифестации заболевания, наличие онкологически отягощенного семейного анамнеза и наличие ПМЗН, характеризовались 89% пациентов с выявленными патогенными вариантами в гене BRCA1 и 70% пациентов – носителей повреждений в гене BRCA2 (табл.4).

Преобладающим гистологическим типом опухоли у носителей патогенных вариантов в генах BRCA1/2 являлась серозная карцинома высокой степени злокачественности. Все пациенты, кроме одного, имели данный гистологический тип опухоли. Серозная карцинома низкой степени злокачественности была выявлена у пациента с патогенным вариантом 5382insC в гене BRCA1 . У всех больных РЯ – носителей повреждений в генах BRCA1/2 , кроме одного пациента с патогенным вариантом c.3881T>A в гене BRCA2 , заболевание было диагностировано на поздней стадии (3-4) (табл. 4).

Табл. 4. Сравнение BRCA1 - и BRCA2 -ассоциированного РЯ по основным клиникоморфологическим характеристикам

Характеристика	Больные раком яичников с патогенным вариантом в гене BRCA1 (n=53)	Больные раком яичников с патогенным вариантом в гене BRCA2 (n=10)
Возраст
Средний возраст манифестации заболевания, лет	47 (29-64)	52 (39-60)
до 50 лет, чел. (%)	34 (64)	3 (30)
51 год и старше, чел. (%)	19 (36)	7 (70)
Семейный онкологический анамнез
Отягощен, чел. (%)	40 (75)	7 (70)
Не отягощен, чел. (%)	13 (25)	3 (30)

Диагноз
Первично-множественные злокачественные новообразования (рак яичников + рак молочной железы, рак яичников + рак эндометрия, рак яичников + колоректальный рак), чел. (%)	27 (51)	5 (50)
Рак яичников, чел. (%)	26 (49)	5 (50)
Гистологический тип опухоли
Серозная карцинома высокой степени злокачественности, чел. (%)	52 (98)	10 (100)
Серозная карцинома низкой степени злокачественности, чел. (%)	1 (2)	0 (0)
Эндометриоидная карцинома, чел. (%)	0 (0)	0 (0)
Муцинозная карцинома, чел. (%)	0 (0)	0 (0)
Светлоклеточная карцинома, чел. (%)	0 (0)	0 (0)
Стадия
1-2, чел. (%)	0 (0)	1 (10)
3-4, чел. (%)	53 (100)	9 (90)
Наличие клинических признаков наследственного заболевания
С клиническими признаками заболевания, чел. (%)	47 (89)	7 (70)
Без клинических признаков заболевания, чел. (%)	6 (11)	3 (30)

Обсуждение

Результаты проведенного исследования показали, что эпителиальный РЯ в российской популяции характеризуется достаточно высокой частотой и широким спектром герминальных патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2. Однако генетический вариант 5382insC в гене BRCA1 встречается в нашей популяции на порядок чаще, чем все остальные выявленные повреждения в данных генах, что подтверждает предположение о его славянском происхождении [2,8].

Среди патогенных вариантов, выявленных методом высокопроизводительного секвенирования, наиболее часто встречалось изменение нуклеотидной последовательности с.1510delC в гене BRCA1 . Данный генетический вариант описан в литературе, в том числе в отечественных публикациях. Он ранее был выявлен в российской популяции как у больных РМЖ, характеризующихся клиническими признаками наследственного заболевания, так и у пациентов с серозным РЯ высокой степени злокачественности [11,12].

Все остальные выявленные генетические варианты также описаны в научных публикациях и внесены в зарубежные базы данных, кроме двух делеций со сдвигом рамки считывания (c.3880_3883delTTAC, c.5855delT), выявленных впервые.

Сопоставимость частот патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA1 , входящих в «стандартные» диагностические панели, за исключением изменения нуклеотидной последовательности 5382insC в гене BRCA1, и клинически значимых генетических вариантов, выявленных методом NGS, свидетельствует о целесообразности оптимизации алгоритма молекулярно-генетического обследования больных эпителиальным РЯ в российской популяции. На первом этапе обследования достаточно протестировать пациентов только на наличие варианта 5382insC в гене BRCA1 методом ПЦР в реальном времени. При отсутствии данного патогенного варианта необходимо проанализировать всю кодирующую часть генов BRCA1 и BRCA2 методом высокопроизводительного секвенирования.

Группа больных BRCA2 -ассоциированным РЯ характеризовалась более высоким средним возрастом манифестации заболевания (52 года), по сравнению с группой больных РЯ с повреждениями в гене BRCA1 (47 лет), что согласуется с данными литературы [13].

Отсутствие клинических признаков наследственного заболевания у 11% пациентов -носителей патогенных вариантов в гене BRCA1 и у 30% больных РЯ с клинически значимыми вариантами в гене BRCA2 подтверждает необходимость проведения молекулярногенетического обследования для выявления повреждений в данных генах всем больным эпителиальным РЯ.

Анализ результатов настоящего исследования показал, что большинство BRCA -ассоциированных опухолей яичников являются серозными карциномами высокой степени злокачественности, диагностированными преимущественно на поздних стадиях, что подтверждается результатами ранее проведенных исследований [6,14].

Выводы

Таким образом, эпителиальный РЯ в российской популяции характеризуется достаточно высокой частотой и широким спектром герминальных патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 , поэтому использование только «стандартных» диагностических панелей может привести к получению ложноотрицательных результатов. Использование метода высокопроизводительного секвенирования позволяет повысить эффективность диагностики герминальных патогенных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 у больных эпителиальным РЯ по крайней мере в 2 раза. Клинико-морфологические особенности BRCA -ассоциированного эпителиального РЯ свидетельствуют о необходимости проведения молекулярно-генетического тестирования всем пациентам с данным диагнозом, в первую очередь с серозной карциномой высокой степени злокачественности.

Вклад авторов. Е. И. Новикова: сбор клинического материала, проведение молекулярногенетических исследований, анализ и статистическая обработка результатов, подготовка и написание текста статьи; Е. А. Кудинова: анализ литературы, анализ результатов исследования; В. К. Боженко: анализ результатов, редактирование текста статьи. Все авторы прочитали и согласились с версией рукописи.

Финансирование. Собственные средства ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России.

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Исследование одобрено этическим комитетом РНЦРР (протокол № 3 от 27 марта 2020 г.) Все пациенты, включенные в исследование, подписали добровольное информированное согласие на его проведение.