Характеристика гуморального и клеточного звена иммунной системы, показателей апоптоза лимфоцитов у пациенток с бесплодием, имеющих высокие уровни сывороточных антиспермальных антител

Актуальность. Общая частота бесплодного брака колеблется от 10 до 20 %, частота женского бесплодия составляет 47,5-53,5 % [4]. Одной из форм иммунологического бесплодия являются состояния, характеризующиеся наличием высоких уровней антиспермальных антител в сыворотке крови пациентов. Данная форма женского бесплодия встречается у 9-36 % нефертильных пар [6]. Антиспермальные антитела, взаимодействуя в жидкостях женского репродуктивного тракта со сперматозоидами, вызывают нарушение их подвижности, а также блокируют мембранные молекулы, необходимые для взаимодействия с яйцеклеткой [2]. Возможно также участие антиспермальных антител в запуске иммунологических механизмов, повреждающих оболочку сперматозоидов.

Современные авторы выделяют ряд факторов, способствующих повышенной выработке антиспермальных антител. К ним относят хронические воспалительные заболевания половых органов, инфекции, передающиеся половым путем, генитальный эндометриоз, отягощенный аллергологический анамнез [1]. Вместе с тем нет ясного представления о механизмах реализации влияния этих факторов на развитие антиспермального иммунитета. Придается большое значение нарушению процессов иммунологической толерантности - «неотвечаемости» на некоторые антигены, что сопровождается активацией клонов лимфоцитов, продуцирующих антиспермальные антитела. В норме элиминацию подобных клонов лимфоцитов, возможно, осуществляют процессы апоптоза. В то же время существует явный дефицит работ, посвященных оценке состояния гуморального и клеточного звена иммунной системы, а также программированной ги бели лимфоцитов у пациенток с повышенными уровнями антиспермальных антител.

Целью исследования является оценка гуморального иммунитета, популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, процессов апоптоза у пациенток с бесплодием, сочетающимся с высокими уровнями антиспермальных антител.

Материалы и методы. Обследовано 108 пациенток с бесплодием (первичным или вторичным). Контрольную группу составили 23 соматически здоровых женщин фертильного возраста, не имеющих патологии репродуктивной системы. Пациентки с бесплодием были разделены на 2 группы: с высоким уровнем антиспермальных антител (> 65,00 Е/мл) - 74 женщины и с низким уровнем (0-35,00 Е/мл) - 34 женщины. Критерием исключения были промежуточные уровни антиспермальных антител (от 36,00 до 65,00 Е/мл) в сыворотке крови пациенток.

У пациенток, составляющих 1-ю группу, первичное бесплодие регистрировалось в 51,4 % случаев (38 женщин), вторичное бесплодие в 48,6 % (36 женщин). Во 2-й группе пациенток с первичным бесплодием было 19 (55,9 %), а имеющих вторичное бесплодие - 15 (44,1 %). Следовательно, соотношение первичного и вторичного бесплодия в обследуемых группах практически не отличалось.

По социальному составу пациентки всех трех групп были сопоставимы. Они не имели достоверных отличий по возрасту. Медиана возраста в первой группе составила 28 лет (квартили 26-32), во второй 29 лет (квартили 27-33), в группе контроля -также 29 лет (квартили 26-31).

Для обнаружения антиспермальных антител в сыворотке крови использовали иммуноферментный

Медианы уровней IgA, IgM, IgG в сыворотке крови пациенток с бесплодием на фоне высокого и низкого содержания антиспермальных антител в сопоставлении с группой контроля: * - достоверное отличие от группы [АСАТ < 35 Е/мл]; **-достоверное отличие от группы [АСАТ < 35 Е/мл] и от группы контроля

метод (тест-система Sperm-antibody-elisa, Bioserv, Германия). Сывороточные уровни иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определяли иммунофермент-ным методом с помощью тест-системы «Иммуноскрин - G, М, А - ИФА - БЕСТ», производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Популяционный спектр лимфоцитов оценивали путем CD-типирования непрямым иммуноф-люоресцентным методом с использованием мышиных моноклональных антител к соответствующим антигенам человека, а также меченых ФИТЦ Fab-фрагментов кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (НПО «Препарат», Н. Новгород). Определяли общее число лейкоцитов периферической крови, процент и абсолютное число лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), Т-цитотоксических (CDS4), В-лимфоцитов (CD224), NK-клеток (CD16+), а также лимфоцитов с маркерами активации CD25, CD71, HLA-DR и готовности к апоптозу - CD95.

Апоптоз лимфоцитов периферической крови изучали морфологически путем подсчета лимфоцитов с фрагментацией ядра при люминесцентной микроскопии мононуклеаров, окрашенных суправитальным ядерным красителем Hoechst 33342 (Boehringer Mannheim).

Иммуноферментным методом с помощью тест-систем Bender Medsystems (Austria) определяли в сыворотке крови уровень растворимых рецепторов, регулирующих апоптоз клеток: ингибитора апоптоза sFas (растворимого CD95ZFas/Apo-l) и проапоптогенного фактора sFasL (растворимого Fas-лиганда).

Статистическая обработка результатов Данные были обработаны с использованием пакета программ Statistica 6.0. Результаты представлены в виде медианы (Me) и квартилей - нижнего и верхнего (QL-QU). Достоверность отличий сопоставляемых групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, позволяющего работать с данными независимо от вида их распределения (значимыми считали отличия при р < 0,05). Корреляционный анализ проводили по Спирмену.

Результаты исследования и их обсуждение. Увеличение уровня антиспермальных антител в сыворотке крови пациенток с бесплодием может отражать как проявление специфического иммунного ответа против спермальных антигенов, так и общее изменение антителопродукции вследствие нарушения функции гуморального звена иммунной системы. Для общей оценки гуморального иммунного ответа мы провели сопоставление уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G у обследованных женщин (см. рисунок).

Как следует из рисунка, у женщин с бесплодием, имеющих высокие уровни антиспермальных антител, достоверно увеличено содержание всех анализируемых классов иммуноглобулинов в сыворотке крови, что может свидетельствовать о поликлональной активации В-лимфоцитов.

Были обнаружены отличия в популяционном составе лимфоцитов (табл. 1).

Как следует из табл. 1, у пациенток с бесплодием, сочетающимся с гиперпродукцией антиспермальных антител, в сопоставлении с пациентками,

Униговская М.В., Теплова С.Н., Медведев Б.И., Иванов Е.А.

Характеристика гуморального и клеточного звена иммунной системы, показателей апоптоза...

имеющими низкие их уровни, увеличено абсолютное число лимфоцитов периферической крови и число CD4+клеток (Т-хелперов). Кроме того, у них наблюдается увеличение абсолютного числа лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации -CD25 и HLA-DR, что в целом свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета.

Апоптоз лимфоцитов - один из важных меха низмов поддержания иммунного гомеостаза. Как следует из табл. 2, наиболее выраженные изменения программированной гибели лимфоцитов выявлены у пациенток 1-й группы, которая достоверно отличалась от контрольной группы здоровых женщин более высокой численностью клеток с готовностью к апоптозу (CD954), повышенным числом лимфоцитов с морфологическими призна-

Таблица1

Характеристика популяционного спектра лимфоцитов обследуемых пациенток

Показатели	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Достоверность отличий между группами (р) согласно тесту Манна-Уитни
	Высокий уровень АСАТ+ бесплодие	Низкий уровень АСАТ+ бесплодие	Здоровые (контроль)
	Me QL-QU	Me QL-QU	Me QL-QU	1-2	1-3	2-3
АСАТ	79,42 70,70-96,00	10,14 6,90-20,25	-	< 0,001	-	-
Лейкоциты	5,45 4,50-6,40	5,00 4,20-5,80	4,80 3,80-5,80	0,086	0,028	0,361
Лимфоциты, х109/л	1,55 1,17-2,08	1,41 1,05-1,56	1,54 0,91-2,18	0,037	0,406	0,402
CD3, х109/л	1,08 0,84-1,47	0,94 0,73-1,14	0,97 0,62-1,43	0,235	0,297	1,000
CD4, х109/л	0,65 0,49-0,85	0,53 0,39-0,65	0,55 0,35-0,84	0,046	0,235	0,641
CD8, х109/л	0,40 0,32-0,54	0,35 0,29-0,41	0,35 0,21-0,53	0,109	0,183	0,776
CD22, х109/л	0,37 0,27-0,52	0,31 0,26-0,38	0,27 0,19-0,43	0,163	0,056	0,649
CD 16, х109/л	0,31 0,21-0,41	0,25 0,22-0,31	0,23 0,17-0,36	0,124	0,094	0,562
CD25, х109/л	0,18 0,15-0,28	0,16 0,13-0,22	0,15 0,09-0,24	0,015	0,027	0,478
СП71,х109/л	0,21 0,15-0,33	0,20 0,17-0,29	0,18 0,12-0,29	0,971	0,261	0,366
HLA-DR, х109/л	0,33 0,21-0,49	0,25 0,21-0,34	0,29 0,19-0,43	0,028	0,275	0,406

Таблица 2

Данные показателей, характеризующие процессы апоптоза

Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Достоверность отличий между группами (р) согласно тесту Манна-Уитни Высокий уровень АСАТ+ бесплодие Низкий уровень АСАТ+ бесплодие Здоровые (контроль) Me QL-QU Me QL-QU Me QL-QU 1-2 1-3 2-3 СП95,х109/л 0,16 0,12-0,21 0,14 0,12-0,18 0,12 0,07-0,17 0,436 0,003 0,028 Лимфоциты с признаками апоптоза - фрагментацией ядер, х109/л 0,10 0,07-0,15 0,10 0,05-0,12 0,07 0,04-0,12 0,158 0,016 0,215 sFas, пг/мл 74,51 66,01-79,10 54,37 32,56-72,75 79,03 77,24-84,21 0,041 0,197 0,042 sFasL, нг/мл 0,50 0,42-0,54 0,42 0,34-0,55 0,17 0,14-0,35 0,580 0,003 0,062 ками апоптоза и более высоким уровнем sFasL в сыворотке, что отражает усиление процессов программированной клеточной гибели. Известно, что рост растворимых регуляторных белков при апоптозе может быть связан с протеолитическим отщеплением мембранных рецепторов (Fas, FasL); в ряде случаев образование sFas, sFasL может осуществляться за счет механизма альтернативного сплайсинга [3]. Растворимый sFasL может индуцировать апоптоз путем взаимодействия с мембранным Fas-рецептором [5].

При сопоставлении показателей апоптоза в группах пациенток с высокими и низкими уровнями антиспермальных антител единственным достоверным отличием является более высокое содержание сывороточного sFas в 1-й группе (см. табл. 2).

Таким образом, у пациенток с бесплодием с повышенными уровнями антиспермальных антител в сравнении с пациентками, страдающими бесплодием с низкими уровнями этих антител, выявлен рост количества лимфоцитов в крови, признаки их поликлональной активации, увеличение содержания sFas в сыворотке.

Выводы

• 1.    У пациенток с высокими уровнями антиспермальных антител наблюдается усиление общей антителопродукции, что может отражать активацию гуморального иммунного ответа.

• 2.    Наибольшие изменения популяционного состава лимфоцитов характерны для группы пациенток с повышенным уровнем антиспермальных антител. Установлено увеличение абсолютного

• 3.    При бесплодии у пациенток с высокими уровнями антиспермальных антител в сопоставлении с пациентками, имеющими низкие уровни этих антител, отмечается более высокое содержание sFas в сыворотке, при отсутствии отличий по другим показателям апоптоза.

числа лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации (CD25, HLA-DR), количества CD4 лимфоцитов.