Характеристика трансплантата клеток костного мозга по уровню его энергетического потенциала.
Автор: Пархоменко Т.В., Михайлова Н.Б., Афанасьев Б.В., Галибин О.В., Томсон В.В.
Журнал: Вестник гематологии @bulletin-of-hematology
Рубрика: Оригинальные статьи
Статья в выпуске: 3 т.12, 2016 года.
Бесплатный доступ
Целью выполненной работы была разработка метода оценки качества трансплантата клеток костного мозга (ККМ) по изменению их энергетического состояния с помощью витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодида 2[п-(диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP). Экспериментальные исследования выполнены на образцах суспензии нативных ККМ20 доноров в стандартном растворе стабилизатора, которые хранились при комнатной температуре. После перемешивания суспензии клеток из нее отбирали пробы: исходнуюи через 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48, 72 часа хранения,окрашивали с помощью зонда 2-Di-1-ASP и исследовали на люминесцентном микроскопе. Регистрировали величину интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 70-100 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ККМ (F усл. ед.); определяли количество ядросодержащих клеток (NC,%). Для оценки количества клеток с неповрежденными цитоплазматическими мембранами использовали тест с трипановым синим. Наличие митозовв суспензии через 6 и 24 часа хранения показано в мазках ККМ, окрашенных по методу Романовского. Статистический анализ динамики изменений F и NC в каждом образце осуществляли при помощи дисперсионного анализа зависимых выборок ANOVA Repeated Measures.По всем образцам проведен кластерный анализ (метрика Эвклида, стратегия ближайшего среднего). Во всех образцах ККМ через 3 часа храненияпри комнатной температуре регистрировалсярост F, обусловленный увеличением количества клеток с интенсивностью флуоресценции выше 100 усл.ед. (NF>100) по сравнениюс исходными значениями, при этом степеньэтого нарастания коррелировала с увеличением Nf>100. Показано, что чем выше NF>100 через3 часа хранения, тем больше прирост концентрации ядросодержащих клеток в суспензии,который начинался через 5 часов хранения.Этот факт может свидетельствовать о способности исследуемых клеток к делению. При возрастании NF>100 через 3 часа хранения ККМ менее чем в 1,66 раза по сравнению с исходной величиной, концентрация ядросодержащих клеток практически не изменялась, что свидетельствовало об утрате способности клеток к делению в данных условиях. Предложен метод оценки качества трансплантата ККМ с помощью витального флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда 2-Di-1-ASP при комнатной температуре в растворе стандартного стабилизатора.
Клетки костного мозга, энергетическая активность, качество трансплантата, витальный флуоресцентный потенциал-чувствительный зонд иодид 2-[п-диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния, способность ккм к делению
Короткий адрес: https://sciup.org/170172517
IDR: 170172517
Characterization of the transplant of the bone marrow cells by the level of its energy potential.
The goal of this study was to develop a methodfor rapid and adequate assessment for assessingthe quality of the graft bone marrow cells (BMC)on the change of their energy state using vitalfluorescent potential-sensitive probe iodide 2[p-(dimethylamino)styryl]-1-methylpyridinium(2-Di-1-ASP). Experimental studies were performed onsamples of native BMC suspension of 20 donorsin a standard solution of the stabilizer that werekept at room temperature. After mixing the cellsuspension were selected from it: the initial specimen and through 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48, 72 - hoursstorage, stained with a probe 2-Di-1-ASP andexamined for the fluorescent microscope. Eachspecimen was measured by fluorescence 70-100single cells and mean fluorescence intensity ofBMC (F, arb.uints) was calculated. In each specimen was determined by the number of nucleatedcells (NC, %). Initially, the proportion of cells withintact cytoplasmic membranes in the specimenswere 80-92 % (by trypan blue test). The presence of mitoses in the samples of the suspensionafter 5 and 24 hours storage is shown in smearsof BMC, painted by the method Romanovsky. Statistical analysis of the dynamics of changes inF and NC in each sample was performed usinganalysis of variance dependent selections ANOVARepeated Measures. For all 20 donors was carried out by cluster analysis (Euclidean metric,strategy nearest middle). In all specimens, the BMC after 3 hours of storage at room temperature recorded F increasefrom baseline due to increase in the proportion ofcells with fluorescence intensity higher than 100arb.uints (N ); the degree of this increase correlates with an increase in NF>100. It is shown thatthe higher NF>100 3 hours after storage, the largerthe increase in the concentration of nucleatedcells in suspension, which started after 5 hoursstorage, being in accordance with revealed abilityof cells to division. With increasing NF>100 through3 hours storage BMC less than 1,66 times compared with the initial value, the concentrationof nucleated cells remained almost unchanged,indicating that the inability of cells to division inthese conditions. Developed and proposed a method for assessing the quality of the graft BMC of using the vitalfluorescent potential-sensitive probe 2-Di-1-ASPat room temperature in a solution of a standard stabilizer.
Список литературы Характеристика трансплантата клеток костного мозга по уровню его энергетического потенциала.
- C. Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Human Hematopoietic Colonies in Health and Disease.// Acta Haemotologica (ISSN0001-5792). 2005. Vol.113. № 1. P. 5-96.
- Takaue Y., Reading C. L., Roome A. J., Dicke K. A., Tindle S., Chandran, M., Devaraj B. Limiting-Dilution Analysis of the Effects of Colony-Stimulating Factors, Phytohemagglutinin, and Hydrocortisone on Hematopoietic Progenitor Cell Growth // Blood. 1987. Vol. 70. № 5. P 16111618.
- Takaue Y., Reading C. L., Watanabe T. et.al. Cell-mediated suppression of human hematopoiesis: evaluation by limiting-dilution analysis of hematopoietic progenitors // American Journal of Hematology. 1989. Vol. 32. № 3. P. 205-211.
- Ventura G. J., Hester J. P., Buescher E. S., Vadhan-Raj S., Durrett A., Reading C. L. // Hematopoiesis in limiting dilution cultures: influence of cytokines on human hematopoietic progenitor cells. Experimental Hematology. 1990. Vol. 18. № 8. P. 878-882.
- Дыгай А. М., Скурихин Е. Г., Першина О. В., Андреева Т. В., Хмелевская Е. С., Минакова М. Ю. // Роль кроветворных предшественников разных классов в механизмах действия грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворение при цитостатической миелосупрессии. 2010. Том. 149. С. 400-404.
- Воробьев А. И., Дризе Н. И., Чертков И.Л. Схема кроветворения. Пробл. Гематологии. 1995. Том. 1. № 1. С. 7-14.
- Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., Наука, 1989. 277 С.
- Vida T. A., Emr S. D. A new vital stain visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. Journ. of Cell Biol. 1995. Vol. 228. № .5. P. 779-792.
- Пархоменко Т. В., Михайлова Н. Б., Афанасьев Б. В., Галибин О. В., Томсон В. В. RU № 2537141, опубл. 27.12.2014, Бюлл. № 36.
- Wandelt B., Mielniczak A., Turkewitsch P., Darling G. D., Stranix B. R. Substituted 4-[4-(dimethylamino)styryl]pyridinium salt as a fluorescent probe for cell microviscosity // Biosensors and Bioelectronics. 2003. Vol. 18. P. 465-471.
- Parkhomenko T. V., Morozova G. I., Klytsenko O. A., Tomson V. V. Evaluation of restoring Erythropoietin (EPO) effect on rat T-lymphocytes after their treatment with some inhibitors in vitro // Annals of Hematology. 2003. Vol. 82. № 6. S. 114.
- Parkhomenko T. V., Klytsenko O. A., Tomson V. V. Erythropoietin stimulates aerobic and anaerobic processes in rat cardiomyocytes // Focus uni-luebeck. Supplement. 2012. P. 37
- Артюхов В. Г, Путинцева О. В., Брагина В. А., Пашков М. В., Василенко Д. В. Флуоресцентные методы в исследовании УФ — индуцированных изменений структурно-функционального состояния лимфоцитов крови человека // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2012. Том. 153. № 6. С. 891-895;
- Морозова Г И., Пархоменко Т. В., Клыценко О. А., Томсон В. В. Стимулирующее влияние эри-тропоетина на энергетику тимоцитов, выявляемое in vitro по флуоресценции потенциал-чувствительного зонда в митохондриях. Биологические мембраны. 2007, Т. 24, № 6, С. 472-478;
- ПархоменкоТ.В., Михайлова Н.Б., Афанасьев Б.В., Галибин О.В.,Томсон В.В.Оценка состояния клеток костного мозга по изменению интенсивности свечения флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда иодид 2-[п-(диметиламино)стирил]-1-метилпиридиния // Клинико-лабораторный Консилиум. 2014. Том. 48. № 1. С. 88-93].
- Kaur A, Jankowska K, Pilgrim C, Fraser ST, New EJ. Studies of Hematopoietic Cell Differentiation with a Ratiometric and Reversible Sensor of Mitochondrial Reactive Oxygen Species// Antioxid. Redox Signal. 2016. Vol. 24. № 13. P. 667-679.
- Фрегатова Л. М., Зубаровская Л. С., Эстрина М. А., Головачёва А. А., Бабенко Е. В., Платонова Г. Г., Зуева Е. Е., Афанасьев Б. В. Методы получения стволовых клеток у больных и доноров для их последующей трансплантации // СПб, Изд. СПбГМУ кафедра гематологии, трансфузиологии, трансплантологии ФПО. 2004. 36 С.
- Клиническая лабораторная аналитика, том 2. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. Под общей редакцией Меньшикова В. В., М., «Лабинформ», РАМЛД, 1999.
- Phelan M. C. Basic techniques for mammalian cell tissue culture // Current Protocols in Cell Biology. 0:1.1.1-1.1.10. 1998.
- Пархоменко Т. В., Галибин О. В., Михайлова Н. Б., Бабенко Е. В., Томсон В. В. RU №2488826, опубл. 27.07.2013, Бюлл. № 21.
- Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. Под ред. Баша-рина Г. П. М.: Мир. 1982. 488 С.
- Алексеева Н. П. Анализ медико-биологических систем. Реципрокность, эргодичность, синонимия. СПб: Изд-во С. — Петерб. Ун-та. 2012. 184 С.
- Lioznov M. V., Freiberger P., Kroger N., Zander A. R., Fehse B. Aldehyde dehydrogenase activity as a marker for the quality of hematopoietic stem cell transplants // Bone Marrow Transplantation. 2005. Vol. 35. № 9. P. 909-914.
