Характеристика влагалищного микробиома у коров при нормальном и патологическом течении послеродового периода

Среди наиболее распространенных причин симптоматического бесплодия у коров выделяются воспалительные процессы репродуктивной системы, такие как острые и хронические метриты, возникающие в результате инфицирования органа патогенными и условнопатогенными микроорганизмами. Контаминация матки, как правило, осуществляется в процессе родов и в раннем послеродовом периоде, в том числе восходящим и контактным путями из нестерильного влагалища [5, 6, 7].

Микрофлора влагалища представляет собой сложный биоценоз, способствующий естественной резистентности организма и поддерживающий репродуктивное здоровье [8, 9, 10]. Важность влагалищной микрофлоры в колонизации пищеварительных и дыхательных органов новорожденных подчеркивает ее влияние на жизнеспособность потомства [11, 12]. Микробный состав влагалища определяется множеством факторов, особенно физиологическим состоянием самки [13]. Таким образом, для понимания биологической роли вагинального биоценоза и разработки методов диагностики, профилактики и лечения репродуктивных патологий необходимо детальное изучение микробного сообщества в различные периоды онтогенеза [14, 15]. Исследования микрофлоры влагалища коров и телок при различных состояниях репродуктивных органов представляют особую ценность для ветеринарной науки, при этом необходимо учитывать, что традиционные методы не всегда обеспечивают полноценное описание микробного состава. Наиболее эффективным подходом к оценке микробиоценозов являются методы, основанные на выявлении и идентификации микробной ДНК [16, 17].

Цель исследований – дать характеристику микробиоценоза влагалища у крупного рогатого скота при нормальном и патологическом течении послеродового периода.

Условия, материалы и методы. Исследования проведены в 2024 году в лаборатории сельскохозяйственной геномики Института агробиотехнологий им. А.В. Журавского Коми НЦ УрО РАН. Объектом исследований служил голштинизированный крупный рогатый скот холмогорской породы, принадлежащий ООО «Межадорское» Сысольского района

Республики Коми. Средняя молочная продуктивность стада по результатам 2023 года составила более 9200 кг молока в год. С помощью случайной выборки была сформирована группа нетелей (n=6 гол.), группа коров-первотелок с нормальным течением послеродового периода (n=6 гол.) и группа животных, у которой были выявлены признаки острого гнойно-катарального эндометрита (n=6 гол.). Оценка состояния репродуктивных органов проводилась с использованием трансректальной ультразвуковой сонографии УЗ-сканером Easi-Scan 4.0, а в послеродовой период дополнительно оценивался характер влагалищноматочного содержимого с помощью акушерской ложки Панкова.

Материал для исследований от нетелей получали в 2…3 месячной срок стельности, а от новотельных коров – на 14…20 день послеродового периода. Для этого, после проведения туалета наружных половых органов от животных стерильной ложкой Люера, с заднебокового свода влагалища брали соскоб слизистой, 100 мкл полученной массы насасывали стерильным инсулиновым шприцом и помещали в пробирку типа Эппендорф содержащей 500 мкл муколитической транспортной среды «Стор-М» (ООО «ДНК-Технология» г. Москва). Пробирки доставляли в лабораторию, гомогенизировали путем встряхивания, центрифугировали при 15 тыс. об. в течение 10 минут, после чего надосадочную жидкость удаляли с таким расчетом, чтоб в пробирке осталось 100 мкл содержимого. Выделение ДНК проводили с использованием набора «Проба-НК-Плюс» (ООО «ДНК-Технология» г. Москва) согласно инструкции производителя. Исследование микробиоценоза влагалища крупного рогатого скота осуществляли путем постановки ПЦР в реальном времени с применением медицинской тест-системы Фемо-флор® 16 (ООО «ДНК-Технология» г. Москва). ПЦР проводили на детектирующем амплификаторе «ДТлайт 4S1» в режиме, рекомендованном производителем для данного набора. Специфичность генотипирования проверяли контрольными образцами, входящими в состав диагностического комплекта.

Цифровой материал обработан методом вариационной статистики на достоверность различия сравниваемых показателей в программе Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Характеристика микробиоты влагалища у крупного рогатого скота, установленная путем ПЦР-анализа, представлена в таблице 1. Как показала молекулярно-генетическая оценка, в образцах слизистой, которые подвергались исследованию, не были обнаружены молочнокислые бактерии, выступающие в роли основных симбионтов влагалища человека. Так же в соскобах слизистой исследуемых животных не были идентифицированы возбудители микоплазменной урогенитальной инфекции.

Установлено, что при нормальном течении послеродового периода наблюдается выраженное снижение микробной загрязненности слизистой оболочки влагалища. Так, общее количество генетического материала микроорганизмов уменьшалось на 106,60 (р≤0,05), по сравнению с показателем на момент первой стельности. В случае развития воспалительного процесса общая бактериальная масса наоборот увеличивалась на 106,76, по отношению к значениям до отела, и на 106,99 (р≤0,05) по отношению к показателю здоровых животных. Количество не идентифицированных микроорганизмов при физиологическом течении послеродового периода снижалось на 106,43 (р≤0,05), а при патологическом на 106,00, таким образом, превосходя значения второй группы на 106,23 (р<0,05).

Анализ концентрации факультативно -анаэробных микроорганизмов свидетельствует, что содержание стрептококков, независимо от особенностей течения послеродового периода, характеризуется меньшим на 10^3,26…10^3,38 (р≤0,05) показателем, однако при воспалении полового тракта превосходит уровень здоровых животных на 10^2,77 (р≤0,001). Содержание бактерий семейства Enterobacteriaceae по окончанию гестации снижается на 10^5,10… 10^5,29, при этом у животных с послеродовой патологией их количество было выше на 10^4,86 (р≤0,05), по сравнению с первотелками без осложнений. В пробах, полученных от нетелей, геном стафилококков не был выявлен в детектируемом количестве, тогда как в послеродовом периоде, независимо от его течения, происходило увеличение численности данного микроорганизма на 10^3,11…10^3,43 (р≤0,001), при этом у животных с эндометритом концентрация данного кокка была на 10^3,15 (р≤0,05) выше показателя здоровых первотелок.

Таблица 1 – Результаты исследования микробиоценоза влагалища крупного рогатого скота ПЦР-методом при нормальном течение послеродового периода и при эндометрите

Продолжение Таблицы 1

Количество облигатно-анаэробных микроорганизмов, таких как Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Porphyromonas spp. у животных с нормальным течением лохиального периода снижалось на 105,52 (р≤0,05), а при остром эндометрите наоборот увеличивалось на 106,72(р≤0,05). Содержание эубактерий у здоровых животных на 105,36(р≤0,01) было меньше показателя больных, пептострепто-кокков на 105,24(р≤0,01), бактерий рода Ato-pobium на 102,21 (р≤0,001). Концентрация генетического материала таких микроорганизмов как Megasphaera spp., Veillonella spp. и Dialister spp. при воспалении матки увеличивалась на 105,45(р≤0,01), а при отсутствии послеродовой патологии наоборот снижалась на 104,02 (р≤0,05). Схожая динамика наблюдалась по отношению к бактериям рода Lachnobac-terium и Clostridium: снижение показателя у здоровых первотелок (на 105,24; р≤0,01) и рост у заболевших (на 106,17; р≤0,01). Содержание грибов рода Candida независимо от течения послеродового периода увеличивалось на 102,69, при этом у здоровых животных разница была достоверной (р≤0,05). Изменения концентраций других групп микроорганизмов не демонстрировали статистически значимых вариаций.

На следующем этапе была осуществлена сравнительная оценка содержания геномов представителей вагинального микробиоценоза относительно общей выделенной микробной ДНК (табл. 2).

Таблица 2 – Относительное содержание идентифицированной ДНК микроорганизмов в соскобе слизистой влагалища, относительно общей массы ДНК

Продолжение Таблицы 2

Примечание: разница достоверна *р≤0,05, **р≤0,01; ***р≤0,001

Установлено, что после родов процентное содержание не идентифицированных микроорганизмов снижается у всех животных, однако более выражено это происходит при воспалении матки (на 30,94 абс.%; р≤0,01). В процессе нормального течения послеродового периода было зафиксировано увеличение относительной доли стрептококков на 0,13 абс. % (р≤0,05), в то время как при возникновении эндометрита этот показатель продемонстрировал снижение на 0,17 абс. % (р≤0,05). Таким образом, разница между второй и третьей группой составила 0,30 абс.% (р≤0,001). Аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении стафилококков: у здоровых особей уровень оказался на 0,42 абс.% выше (р≤0,001) по сравнению с первотёлками, у которых диагностирован послеродовой метрит. Доля бактерий рода Gardnerella, Prevotella и Porphyromonas , при физиологическом течении лохиального периода оставалась на стабильном уровне. В то же время, в условиях воспаления слизистой оболочки матки наблюдалось значительное увеличение относительной концентрации данных представителей на 34,33 абс.% (р≤0,001). У здоровых коров наблюдался рост эубакте-рий на 5,47 абс.% (р≤0,05), бактерий рода Mo-biluncus и Corynebacterium на 2,56 абс.% (р≤0,001), дрожжеподобных грибов на 0,54 абс.% (р≤0,001), тогда как у заболевших послеродовой патологией животных относительное количество указанных микроорганизмов было ниже показателя коров без патологии на 5,29 (р≤0,05), 3,09 (р≤0,001) и 0,63 (р≤0,001) абс.% соответственно. Процентное содержание бактерий рода Megasphaera spp.,

Veillonella spp. и Dialister spp., оставалось на стабильном уровне при отсутствии послеродовых осложнений, однако в случаях возникновения эндометрита наблюдался рост на 1,85 абс.% (р≤0,001). В то же время относительная концентрация пептострептококков при наличии воспалительного процесса в матке была на 1,87 абс.% (р≤0,001) ниже по сравнению с показателями здоровых коров.

Выводы. Проведенные ПЦР исследования свидетельствуют, что еще до момента первого отела микробиоценоз влагалища крупного рогатого скота представлен широким спектром микроорганизмов, потенциально способных вызвать воспалительную патологию органов размножения. При физиологическом течении послеродового периода наблюдается снижение, как общей бактериальной загрязненности, так и количества отдельных представителей микробиома, а на фоне возникновении эндометрита происходит увеличение численности большинства микроорганизмов, составляющих биоценоз. Сравнительная оценка показывает, что при отсутствии послеродовой патологии матки в полости влагалища наблюдается относительный рост уровня условнопатогенных видов, что связано с изменением соотношения между микроорганизмами, которые диагностируются и не диагностируются используемой тест-системой. При эндометрите отмечается более выраженное уменьшение количества неидентифицируемой микробной ДНК и рост числа таких представителей, как Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia и Porphy-romonas spp, способных вызвать бактериальный вагинит.