Идентификация возбудителя инфекционной патологии осетровых рыб в условиях установки замкнутого водоснабжения

В настоящее время одним из перспективных и эффективных способов выращивания рыбы является индустриальная аквакультура с использованием установок замкнутого водоснабжения (УЗВ), где постоянно поддерживаются оптимальные условия для обеспечения быстрого роста и развития рыб [1].

Вместе с тем, при использовании УЗВ на организм рыб постоянно влияют неблагоприятные техногенные факторы, в том числе высокая плотность посадки, резкие перепады содержания кислорода, применение искусственных кормов, несоблюдение режимов кормления, приводящие в ряде случаев к загрязнению органическими остатками воды бассейна и накоплению в этих условия патогенной микрофлоры [2].

Их воздействие приводит к снижению общей резистентности организма рыб, ослаблению темпа роста, повышению восприимчивости к различным заболеваниям, в том числе и инфекционного характера.

Дальнейшему распространению инфекционных заболеваний среди рыб в условиях аквакультуры в немалой степени способствуют такие факторы передачи как рабочий инвентарь, приборы и оборудования [3, 4].

Высокая концентрация рыб на ограниченном территориальном пространстве УЗВ таит в себе серьезную опасность в виде накопления и спонтанного пассажирования микрофлоры через восприимчивый организм, способствующий резкой вспышке и распространению инфекционных заболеваний [5].

Среди инфекционных болезней осетровых, выращиваемых в условиях УЗВ, все чаще регистрируются псевдомоноз и аэромоноз, При сходной клинике этих заболеваний у рыб до сих пор остаются не выясненными вопросы по их дифференциальной диагностике, выбору эффективных методов лечения и профилактики больных животных.

Основной проблемой в дифференциальной диагностике этих болезней является схожесть по клиникоморфологическому проявлению.

В связи с чем, возрастает значение микробиологических исследования с целью идентификации возбудителей этих болезней. Для идентификации и дифференциации возбудителей, поражающие кожные покровы осетровых рыб были поставлены следующие задачи:

– изучить культуральные, морфологические, тинкториальные, биохимические свойства возбудителей данной патологии рыб;

– проведение контрольного заражения естественно восприимчивых объектов (осетровых рыб), для изучения патогенных свойств возбудителей.

Материалы и методы исследований. Научно-производственный опыт и лабораторные исследования проводились на базе лаборатории биотехнологии НИИ биотехнологии и природопользования ЗападноКазахстанского аграрно-технического университета имени Жангир хана и в бактериологическом отделе ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория РТ».

Объектами исследований послужили сформированные стада сибирских осетров (Acipenser baerii).

После вскрытия сибирского осетра взяты патологические материалы (внутренние органы, область поражение и т.д.) для бактериологического исследования. Высевы произвели из асцитной жидкости, печени, сердца, селезенки, содержимого из полости раны (отдельно из каждой пробы) на скошенный МПА (рН 7,2-7,4). Инкубировали в термостате при 25°С в течении 48 часов.

Идентификация возбудителя проведено согласно схеме, предложенной Кауэн и Стил (S.Т. Cowan, К.I. Steel) , которые в качестве исходного пункта идентификации бактерий производили окраску по Граму. На стадии дифференцирования бактерий учитывают форму клетки, кислотоустойчивость, спорообразование, подвижность, продукцию каталазы, оксидазы, отношение к глюкозе [6, 7].

Изучение морфологических, и тинкториальных признаков микроба является обычно лишь первоначальной стадией его идентификации. Морфология микроорганизмов изучается путем микроскопии фиксированных и окрашенных препаратов, а также живых неокрашенных микроорганизмов в раздавленной капле.

Изучение биохимических свойств произведено согласно инструкции по применению набора реагентов Системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов, набор № 2 для определения межродовой и родовой дифференциации бактерий.

На последующих стадиях исследования, пользуясь таблицами, характеризующими бактерии, относящихся к определенному роду, находят ключ к определению видов, подвидов и типов в соответствии со сборником инструкции по борьбе с болезнями рыб, Часть I. [8]

Биологическую пробу ставили на двух клинически здоровых рыбах того же вида и возраста, от которых выделена культура возбудителя. Двухсуточную бульонную культуру ввели рыбам внутримышечно в дозе 0,5 мл. Одновременно поставили контроль на 2 рыбах, которым ввели стерильный МПБ в тех же дозах. В случае проявления заболевания или гибели рыб проводят бактериологическое исследование.

Лабораторный диагноз считает установленным при повторном выявлении культуры со свойствами, характерной для возбудителей болезни у подопытных рыб.

Результаты исследований. При изучении культуральных свойств возбудителя установлено, что после культивирования отмечен рост на МПА серовато-белых полупрозрачных, круглых выпуклых колоний с ровными краями.

Микроскопирование мазков выросших культур с целью определения морфологических и тинкториальных свойств установило, что возбудитель – грамотрицательная палочка, подвижная, спор и капсулы не образует (рис. 1).

Рис. 1 – Результат микроскопирования культуры

Таблица 1 - Дифференциация бактерий, схожих по морфологическим свойствам

Основные признаки	Pseudomonas	Vibrio	Aeromonas	Результаты исследований
Оксидаза	+	+	+	+
Расщепление  глюкозы на среде Хью-Лейфсона	О/–	О/Ф	О/Ф	—
Лизин-декарбоксилаза	–	+	–	–
Орнитиндекарбоксилаза	–	+	–	–
Аргининдекарбоксилаза	+	—	—	Не проводилось

Обозначения:

– отсутствие продукта реакции;

+ наличие продукта реакции.

Результаты изучения возбудителя для определения отношения к глюкозе, продукции оксидазы и т.д. приведены в таблице 1.

Судя по таблице, исследуемый объект (возбудитель инфекции) относится к бактериям рода Pseudomonas. Для дальнейшей типизации возбудителя провели биохимические исследование, результаты которых в таблице 2.

Таблица 2 - Дифференциация представителей рода Pseudomonas

Основные признаки	Ps. fluo-rescens	Ps. pu-tida	Ps. intes-tinalis	Ps. der-moalba	Ps. aure-ofaciens	Ps. cyp-rinisep-ticum	Результаты исследований
1	2	3	4	5	6	7	8
Наличие капсулы  в мазках	-	-	-	-	-	+	-
Маннит	-	-	К	К	К	-	К
Мальтоза	-	К	К	К	-	-	К
Лактоза	-	К	-	К	К	-	К
Сахароза	К/-	-/К	К	К	К	-	К

*Обозначения:

– отсутствие продукта реакции;

+ наличие продукта реакции;

К – кислотоположительные (образование пузырьков газа в среде)

Пользуясь таблицами, характеризующими бактерии, относящейся к определенному роду, нашли ключ к определению вида и типа. По результатам проведенной типизации установлена принадлежность возбудителя к Pseudomonas dermoalba , специфичной для осетровых рыб.

Биопроба, направленная на определение патогенных свойств возбудителя дала следующие результаты – на 3-4-е сутки наблюдении отмечены клинические признаки, выраженные общей слабостью, вялость в движениях, а также развитием характерных поражении на месте введения бактериальной суспензии. На 6-7-е сутки отмечены гибель рыб. При патологоанатомическом вскрытии этих рыб установлены изменения, свойственные псевдомонозу, тогда как у контрольных рыб, которым ввели стерильный МПБ, клинико-морфологических изменений не наблюдали.

После вскрытия больных рыб и взятия патологического материала провели повторные бактериологические исследования, по результатам которых установили присутствие бактерий рода

Pseudomonas.

Вывод. На основании выполненных культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических исследований в пораженных органах и тканях сибирских осетров, выращиваемых в установках замкнутого водоснабжения, выявлен возбудитель псевдомоноза.

Резюме

На основании выполненных культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических исследований в пораженных органах и тканях сибирских осетров, выращиваемых в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ), выявлен возбудитель псевдомоноза.