Иммунные маркеры и полиморфизм генов у детей в условиях экспозиции тяжелыми металлами

Исследование особенностей иммунной регуляции, играющей ключевую роль в обеспечении го-меосгаза и устойчивого функционирова ния в измененных условиях среды обитания, а также индиви-дуально就 генетической вариабельности по приоритетным генам, которые определяют адаптацион ный потенциал организдіа. имеют важное значение для решения задан сохранения здоровья населения и минимизации последствий негативного внешне-средового воздействия [Зайцева, Устинова. Аминова, 2 011; Долгих и др.? 2012, 2014а, 20146; Зайцева и др.. 2014].

Цель работы - анализ особенностей иммунной регуляции и генетических маркеров у детскогю на-

电 Долгих О. В., Старкова К Г., Кривцов А. В., Бубнова О. А.. Вдовина Н. А.. Пирогова Е. А., 2015

селения в условиях повышенной q>eдOБOй химической нагрузки тяжелыми металлами.

Материалы и методы

Проводили углубленное обследование детского населения в возрасте от 3 до 7 лет (71 ребенок), постоянно потребляющего воду с превышением гигиенических нормативов содержания б ней тяжелых металлов. Группу контроля составили 53 ребенка, проживающие на условно чистой территории с допустимым содержанием металлов в питьевой воде.

Содержание металлов в воде и биосредах детей определяли с помощью масс-спектрометрии с ин-дуктнвно связанной плазмой. Показатели hmwh- ной регуляции: IgE общий, интерлейкин-17, фактор некроза опу^гхоли (ТКҒальфа) исследовали методом имму^гноферментного анализа. Маркеры ги-перчу ветвите льности (специфические IgG и IgE) изучали методом аллергосорбентного тестирования. Оценк\^г фагоцитарной активности проводили с использованием формалинизированных эритроцитов барана, уровнн сывороточных иммуноглобулинов классов А* М* G - методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Фенотипирование лимфоцитов по CD-маркерам и экспрессию маркеров апоптоза рецептора к ТКҒалвфа (TNFRl+ 入 белков рва и Вах изучали с помощью проточной цитометрии методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием меченых моноклональных антител, суммарно регистрируя не менее 10 000 событий. Интенсивность апоптоза оценивали по экспрессии фосфатидил серина с помощью меченого аннсксина V (Anncxin V-FITC) и фрагментации ДНК красителем 7-amino-actinomycin D (7-AAD). Статистический анализ полученных данных проводили с расчетом ^едней арифметической и её стандартной ошибки к t-критерия Стьюдента. Зависимости между признаками оценивали методом корреляционно-регрессионного анализа. Достоверными считались различия между группами при р<0.05

Забор материала для генетического анализа проводили методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Для определения генотипов использовали полимеразною цепную реакцию в режиме реального времени и метод аллельной дискриминации. Обработку данных по генотипированию проводили б программе «Ген Эксперт» на основе диагностики однон ) 'клеотидных полиморфизмов. Проведено изучение полиморфизма гена матриксной металлопротеиначы 9 (ММР9). рецептора запуска апоптоз (FAS), транскрипционного фактора р53 (ТР53),

Результаты и их обсуждение

Натурные исследования территории наблюдения по изучению качества воды хозяйственно питьевого водоснабжения показали его несоответ-ствие установленным гигиеническим нормативам по содержанию стронция (превышение в 1.2 раза от предельно допустимой концентрации, ПДК - 7+0 мг/л)? а также достоверное превышение над соответствующим и показателями качества среды на территории сравнения по маргані^ в 1L5 раз. стронцию в 93 рала, ивнш^ в 7.5 раз* мышьяку в 1.3 раза.

При сравнении результатов содержания металлов в биосредйх детей установлено превышение над показателями группы контроля по стронцию в 4.3 раза и по марганцу в 1.2 рагіа (р<0.05).

Результаты клинико-лабораторного исследования выявили функциональные изменения иммунной системы детей. Выявлено повышение фагоцитарной активности у 53.5-62% обследованных по критерию «процент фагоцитов», «фагоцитарное число», «фагоцитарный индекс», достоверное относительно группы контроля (р<0.05). Математическое моделирование по критериям оценки шансов изменения показателей иммунитета при увеличении содержания металлов в био^едах детей показало достоверное возрастание фагоцитарной активности при повышении концентрации марганца, хрома, мышьяка никеля, стронция в крови (R2=0.21-0.65 при р<0+05).

Содержание сывороточных им штногл обул инов нс отличалось от показателей физиологической нормы, при этом по сравненшо со значениями группы контроля отмечено снижение уровня IgA в 1.2 раза (р<0т05). Анализ отношения шансов изменения показателей гуморального иммунитета при вочрзстании содержания контаминантов в биосре-дах детей установил снижение концентрации IgG и IgM при увеличении концентрации свинца, никеля, мышьяка в крови (R2=0.44-0.75 при р<0.05).

Отмечен повышенный относительно референтного диапазона уровень специфической сенсибилизации к стронцию по критерию IgG, различия достоверны по критерию кратности превышения нормы (0.121±0.05 у© при норме <0.1 у.е.к р<0+05)+ В то же время при сравнении с аналогичными показателями группы контроля выявлено увеличенное содержание IgE к марганца в 2.3 раза (р<0.05).

Показатели мела<леточной цитокиновой рефляции находились б пределах физиологической нормы, однако статистически установлено возрастание шансов повышения ТһіҒальфа при росте концентрации никеля и мышьяка в крови (R2=0.6 l-0r73 при р<0.05), а также интерлейкина-17 при возрастании уровня евннпа. никеля, мышьяка, стронция, хрома в крови (R2=0.44-0.69 при р<0.05).

Исследование маркеров репляции апоптоза (табл. 1) показало негативные изменения, связанные с процессом его запуска как через TNPRL так и через CD95 (Fas-рецептор), экспрессия которых была снижена относительно референтного интервала у 96 6% и 73*3% детей соответственно (р<0₊05). Также у большинства обследованных выявлено значительное уменьшение клеток, экспрессирующих проапоптотический маркер р53. е среднем е 2 』 раза (р<0.05). при этом по фактору Вах достоверных отличий не наблюдалось. В то же время в 44.8% случаев отмечено снижение числа апоптозных Annexin V-FIT С+7 А AD-кл еток. По результатам математического моделирования процесса дальнейшее уменьшение данного показателя достоверно связано с увеличением содержания марганца, мышьяка, хрома, свинца и стронция в крови (R2=0.34-0,77 при р<0.05).

Таблица 1

Особенности изменения маркеров апоптоза у детей, экспонированных тяжелыми металлами

Показатель	Референіный интервал	Груіпш наблюдения
AnnexinV-riTC+ 7AAD~ клетки, %	L 5-2.5	L743±0.27g
CD9 5+-лимфощпы h %	15-25	13.43±1,47*
TNFRf, %	1-1.5	0J4±0,154*
p53, %	1.2-13	O.5O±OJ13*
Bax, %	5-9	8.98 土 3,143

]Іримечание. 需 -ра мнит 圖 достоверна относительно референтного интервала (р<0.05).

Выявленные изменения иммунных показателей у обследованных детей развиваются на фоне негативной генетической вариабельности, связанной с приоритетными генами иммунной регуляциИк апоптоза и онкопролиферации (та6 」+ 2).

Таблица 2

Особенности генетического поіиморфівма у детей, экспонированных тяжелыми металлами (встречаемость генотипов, %)

Ген	Генотип	Группа наблюдения	Группа кон-трешя
FAS	CC	63%	5К%
	СГ	31%	42%
	TT	6%	0%
TP53	CC	48%	44%
	CG	3S%	52%
	GG	14%	4%
MMP9	AA	37.5%	72%
	AG	50%	28%
	GG	12.5%	0%

Проведенный анализ выявил появление мутантного гомозиготного генотипа в группе наблюдения по генам FAS и ММР9 у 6% и 12,5% обследованных соответственно, при его отсутствии в группе контроля. Одновременно повышение встре чаемости минорного аллеля по гену ММР9 связано как с распространенностью гомозиготного, так и гетерозиготного варианта генотипа.

Анализ полиморфизма гена ТР53 позволил установить увеличение встречаемости мутантной го-мозиготы в 3.5 раза относительно группы контроля.

Таким образом, в результате обследования детского населения, потребляющего питьевую воду с превышением гигиенических нормативов содержания в ней тяжелых металлов, выявлены функциональные изменения показателей именной ре-гуляции* характери зу ющиеся повышением фагоцитарной активности, увеличением общей и специфической чувствительности к компонентам факторной нагрузки, а также уменьшением интенсивности процесса апоптоза клетки, опосредованные факторами его запуска и регуляции. Нарушения иммунной реакгиБности ассоциированы с особенностями генетического полиморфизма: мутантным гомозиготным вариантом г€ное F А S-рецептора и ММР9* а также повышением частотности минорной гомозиготы ТР53* ответственных за иммунную регуляцию и апоптоз*