Иммунобиологические свойства аттенуированного штамма ФК-135 вируса африканской чумы свиней, выращенного в суспензии клеток костного мозга свиней

После заноса африканской чумы свиней (АЧС) на Европейский континент (1957 год) усилия многих исследователей были направлены на получение и испытание различных аттенуированных вариантов вируса АЧС с целью разработки специфических средств профилактики, так как инактивированные вакцины при этой болезни оказались неэффективными (1).

Аналогичные исследования проводились и во Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ) (2-6). В ряде экспериментов было показано, что устойчивость свиней к заражению гомологичным вирулентным вирусом АЧС зависит от интенсивности проявления клинической реакции животных на иммунизацию аттенуированными штаммами. Штаммы вируса АЧС, вызывавшие умеренную клиническую реакцию у привитых особей, обеспечивали формирование устойчивости к заражению вирулентными штаммами гомологичных серотипов (3, 7, 8).

И.Ф. Вишняковым с соавт. (4) при пассировании вирулентного штамма Франция-32, относящегося к 4-му серотипу, в культуре клеток костного мозга свиней (КМС) был выделен аттенуированный вариант вируса АЧС — ФК-135. Вирусный материал, который получили на основе этого штамма, выращенного в монослойной культуре клеток КМС, после концентрирования в 25 раз по объему вызывал защиту 85-100 % подсвинков от заражения гомологичным вирулентным вирусом АЧС. Защита наступа-70

ла уже через 7 сут после прививки (3).

В последнее время для получения вирусного сырья с целью изготовления вакцинных препаратов широкое распространение получили методы культивирования с использованием роллерных установок и автоматизированных биореакторов (9, 10).

В настоящей работе представлены результаты изучения антигенной и иммуногенной активности концентрированного эмульгированного ви-руссодержащего препарата вируса африканской чумы свиней, выращенного в суспензии клеток костного мозга свиней.

Методика . В опытах использовали аттенуированный штамм ФК135 вируса АЧС после 9-го пассажа в культуре клеток КМС и эпизоотический штамм Ф-32, прошедший 3 пассажа на свиньях, с инфекционной активностью соответственно 7,50 и 7,33 lg ГАЕ₅₀/см³.

Культуру клеток КМС выращивали на стандартной среде Игла МЕМ («Sigma», США) с двойной концентрацией аминокислот и витаминов, а также в среде на основе растворе Эрла, содержащей ферментативный гидролизат мышечных белков (0,25 % ФГМ-С, разработка ВНИИВ-ВиМ) с 10 % сыворотки крови свиней («БиолоТ», г. Санкт-Петербург). Выращивание вируса осуществляли в течение 4-6 сут в суспензии клеток КМС в автоматизированных биореакторах вместимостью 5 л («NBS», США) и 20 л («Chemap», Швейцария) при оптимальных условиях: плотность суспензии клеток КМС — 3,0* 106 кл/см3, множественность заражения — 0,1 ГАЕ50/кл., скорость вращения турбинной мешалки — 100-120 об/мин, рН 7,2-7,4, скорость подачи газовой смеси (воздух + СО2) — 2 л/ч в расчете на 1 л суспензии. Через каждые 24 ч из реакторов отбирали пробы для определения стерильности культуры, величины рН, общего числа и жизнеспособности клеток, инфекционной и антигенной активности вируса (10). Для контроля вирус выращивали в монослое клеток КМС в матрасах с применением тех же сред и условий.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрировали в 25 раз (по объему) полиэтиленгликолем (ПЭГ, м.м. 6000), а затем эмульгировали, используя с этой целью адъювант (1:1), содержащий подобранные минеральное масло и эмульгатор. Из полученного в трех циклах выращивания вирусного материала приготовили три серии эмульгированного препарата. Определение инфекционной и антигенной активности вируса АЧС, а также серологические исследования концентрированного вируссодержащего материала проводили по методикам, разработанным во ВНИИВВиМ (4). Иммуногенность трех серий препарата изучали на внутримышечно привитых подсвинках массой 25-35 кг. Животных (по 4 гол. на препарат) иммунизировали однократно по 1 см3 и через 7 сут после прививки заражали внутримышечно вирулентным вирусом штамма Ф-32 в дозе 105 ГАЕ50.

Результаты. Вирус АЧС (штамм ФК-135) в суспензии клеток КМС на 4-е сут культивирования в биореакторах накапливался в максимальных титрах (7,50-7,75 lg ГАЕ 50/см3), тогда как в монослое в матрасах (контроль) его инфекционная активность не превышала 7,00-7,25 lg ГАЕ50/см3. Установлено, что комплементсвязывающая активность антигена вируса, выращенного суспензионным методом и в стационарном монослое клеток КМС, в эти же сроки культивирования характеризовалась показателями титров 1:8-1:16. Большее накопление комплементс-вязывающего антигена (КС-антигена) вируса в суспензии клеток КМС наблюдали на 5-6-е сут (1:16-1:32), хотя его инфекционная активность при этом не повышалась. Представленные данные указывают на то, что максимальное накопление КС-антигена вируса АЧС, выращенного в суспензии клеток КМС, происходило через 1-2 сут после того, как регистрировали наибольшую инфекционную активность. Препарат, полученный на основе аттенуированного штамма ФК-135 вируса АЧС (три независимые серии) для последующего тестирования на животных, был стерильным, а инфекционная и КС-активность в сериях характеризовалась значениями соответственно 7,50-7,75 lg ТЦД50/см3 и 1:16-1:32.

После концентрирования в 25 раз по объему и эмульгирования титр вируса в образцах увеличился до 8,00-8,25 lg ТЦД50/см3.

У двух из 12 привитых подсвинков на 3-и и 7-е сут после иммунизации регистрировали повышенную температуру (до 40,5 ° С в течение 1-3 сут) без проявления других клинических признаков. После контрольного заражения у четырех подсвинков на 4-7-е сут отмечали подъем температуры тела до 41,2 ° С в течение 1-3 сут без других признаков болезни. Непривитые (контрольные) животные (4 подсвинка) пали на 8-11-е сут после заражения с признаками и патоанатомическими изменениями, характерными для АЧС.

У животных, привитых указанным препаратом, аттенуированный вирус АЧС выделяли из крови до 10-14-х сут в низких титрах (до 1,52,5 lg ГАЕ50/см3). В моче и фекалиях в эти и более поздние сроки вирус АЧС не обнаружили. Кроме того, не наблюдали передачи вируса от привитых подсвинков интактным путем при их совместном содержании в течение 30 сут (срок наблюдения). В сыворотках крови привитых подсвинков через 14 сут выявляли комплементсвязывающие и преципитирующие антитела в титрах 1:4-1:8, а антител, задерживающих гемадсорбцию вируса, не обнаруживали (срок наблюдения 30 сут).

У привитых таким препаратом подсвинков, которых заражали через 4 мес вирулентным вирусом, специфическая защита сохранялась в течение всего срока наблюдения. После заражения вирулентным вирусом у 7 из 12 животных в период с 3-х по 4-е сут отмечали 1-2-суточное повышение температуры тела до 40,5-41,3 ° С. Остальные подсвинки оставались клинически здоровыми. В контрольной группе животные пали на 7-е и 9-е сут, и у них зарегистрировали клинические проявления и патоана-томические изменения, характерные для АЧС.

Таким образом, при культивировании аттенуированного штамма ФК-135 вируса африканской чумы свиней (АЧС) в суспензии клеток костного мозга свиней в биореакторах максимальное накопление вируса (7,50-7,75 lg ГАЕ50/см3) происходило на 4-е сут, комплементсвязывающе-го антигена (1:16-1:32) — на 5-6-е сут. Концентрированный эмульгированный препарат, изготовленный на основе этого материала, через 7 сут после внутримышечного введения обеспечивал защиту подсвинков против заражения гомологичным вирулентным вирусом в течение 4 мес (срок наблюдения). При этом у привитых животных аттенуированный вирус выделяли из проб крови до 10-14-х сут. Следовательно, вируссо-держащее сырье, полученное суспензионным методом в биореакторах на основе штамма ФК-135, может быть использовано при изучении иммунного ответа животных и молекулярно-генетических свойств вируса АЧС, а также для сравнения с его изолятами, циркулирующими в настоящее время в Российской Федерации, в том числе с целью разработки приемов иммунопрофилактики.

Авторы благодарят заведующую библиотекой ВНИИВВиМ А.Н. Неволину за помощь в подборе и оформлении цитируемых ссылок литературы.