Иммунобиологические свойства зоонозного штамма хламидий "АМК-16"

Хламидиозы имеют широкое распространение среди различных видов животных, в частности сельскохозяйственных. Биология данного вида микроорганизмов обуславливает возможность его передачи от одного вида животных другим, а также человеку [1, 2]. А возможность бессимптомного персистирования в подавляющем большинстве случаев не позволяет выявить данный возбудитель на ранних сроках после его заноса в стадо. Наиболее значимый ущерб, наносимый хламидиями животноводческой сфере, связан с абортами, рождением нежизнеспособного и слабого молодняка, и в меньшей степени с бронхопневмониями, артритами, керато-коньюнктивитами и энцефалитами [3, 4, 5, 6].

Немаловажным фактором, определяющим целесообразность изучения хламидийных инфекций, является ввоз в Россию высокопродуктивного крупного и мелкого рогатого скота из других стран. В связи с чем возрастает угроза возникновения вспышек инфекционных болезней, в том числе и хламидиоза. Поэтому наиболее актуальным направлением исследований в этой области является выделение новых штаммов хламидий, изучение их антигенной структуры и иммуногенности с целью использования их для создания тест-систем и конструирования универсальных вакцин с широким спектром действия, способных создавать иммунитет против всех нозологических форм хламидийной инфекции у представителей всех видов сельскохозяйственных животных.

Ранее нами в ходе проведения клинико-эпизоотологического обследования в неблагополучном по хламидиозу козоводческом хозяйстве из патологического              материала абортировавшей козы был выделен штамм хламидий, который систематически пассируется на развивающихся куриных эмбрионах. Исходя из этого, целью нашего исследования     явилось     изучение биологических свойств выделенного штамма хламидии. Для этого перед нами стояли следующие задачи: определить его инфекционный      титр,      изучить вирулентность на лабораторных животных, а также оценить антигенную и иммуногенную              активность экспериментальной             вакцины, сконструированной на основе штамма «АМК-16».

Материал и методы исследований. Оценку инфекционного титра проводили на развивающихся куриных эмбрионах по методу Рида и Менча.

Оценку вирулентности штамма хламидий «АМК-16» проводили путем постановки биопробы на белых мышах и морских свинках. Белые мыши были разделены на три группы. Первую группу заражали интраназально, вторую – внутрибрюшинно, третью – подкожно. Морские свинки были разделены на две группы, заражение которых проводили интраназальным и внутрибрюшинным введением штамма. Вирулентность штамма определяли по проценту падежа животных в испытуемых группах.

Оценку антигенной активности штамма проводили на морских свинках и кроликах путем постановки РСК со специфическим хламидийным антигеном, используя «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Морские свинки были разделены на четыре группы. Двум группам животных вводили живую культуру хламидий штамма «АМК-16» в виде 10 % суспензии различными методами (внутрибрюшинно и интраназально). Другим двум группам морских свинок была введена инактивированная 10 % суспензия из того же штамма аналогичными методами. Из кроликов были сформированы две группы. Первой группе вводили живую культуру штамма «АМК-16», второй группе кроликов делали инъекцию инактивированной суспензией внутрибрюшинным методом. С целью усиления антигенных свойств и увеличения продолжительности действия специфического противохламидийного гуморального иммунитета была создана экспериментальная вакцина на основе штамма «АМК-16». В качестве адъюванта использовали оригинальный маслоланолиновый адъювант. Оценку антигенной активности экспериментального вакцинного препарата на основе штамма «АМК-16» проводили на морских свинках. Биопрепарат испытуемым животным вводили внутримышечно. Серологические исследования проводились на протяжении 180 дней (каждые 30 суток) после прививки.

Иммуногенность штамма определяли путем постановки биопробы на белых мышах. Четыре группы мышей были иммунизированы антигенном штамма хламидий «АМК-16». Четыре другие группы являлись контролем. Далее проводили заражение всех групп животных четырьмя штаммами хламидий: «АМК-16», «РС-85», «250» и «Ростиново-70». Каждым штаммом заражали по две группы: иммунизированную и контрольную. Иммуногенность штамма «АМК-16» оценивали по индексу защиты, который определяли по соотношению количества павших животных в контрольной группе к количеству павших животных в иммунизированной группе.

Результат исследований. В таблице 1 представлены результаты заражения куриных эмбрионов различными разведениями суспензий из штамма хламидий «АМК-16».

Таблица 1 – Результаты выживаемости куриных эмбрионов после заражения различными концентрациями штамма хламидий «АМК-16»

Разведения инфекционного материала, log 10	Фактические данные			Кумулятивные данные
	пало/общ	выжило	пало	выжило	пало	процент летальности
10-1	10/10	0	10	0	49	100
10-2	10/10	0	10	0	39	100
10-3	9/10	1	9	1	29	97
10-4	8/10	2	8	3	20	87
10-5	6/10	4	6	7	12	63
10-6	4/10	6	4	13	6	31
10-7	2/10	8	2	21	2	7

На     основании     результатов      было установлено, что концентрация исследования и произведенных расчетов     штамма «АМК-16», способная вызывать гибель 50 % куриных эмбрионов в дозе 0,3 мл (LD50/0,3), равняется разведению инфекционного материала 10-5,4. Исходя из этого титр штамма хламидий «АМК-16» равен – lg105,4 LD50/0,3 мл.

В таблице 2 представлены результаты оценки вирулентности штамма «АМК-16» для белых мышей и морских свинок при разных способах инфицирования.

Таблица 2 – Оценка вирулентности штамма «АМК-16» на лабораторных животных

Вид животного	Метод инфицирования	Штамм для заражения	Количество павших животных	Процент павших животных
Белые мыши	Интраназальный	«АМК-16»	60/60	100
	Внутрибрюшинный		43/60	71,6
	Подкожный		17/60	28,3
Морские свинки	Интраназальный	«АМК-16»	3/12	25
	Внутрибрюшинный		0/12	0

Из таблицы 2 видно, что наибольшую вирулентность изучаемый штамм проявляет при интраназальном способе инфицирования лабораторных животных, вызывая 100 % гибель белых мышей и 25 % падеж морских свинок. Штамм менее патогенен при внутрибрюшинном способе заражения. В группе белых мышей, инфицированных этим способом, смертность составила 71,6 %, а в группе морских свинок ни одно животное не пало, хотя у всех животных этой группы наблюдались клинические признаки инфекционного заболевания. Самый низкий процент смертности белых мышей был выявлен при подкожном способе заражения, который составил 28,3 %. В таблице 3 представлены результаты изучения антигенной активности штамма хламидий «АМК-16» на морских свинках и кроликах.

Таблица 3 – Результаты изучения антигенной активности штамма хламидий «АМК-16» на лабораторных животных

Вид животного	Метод заражения	Тип суспензии	Количество животных	Средний титр в РСК
Морские свинки	Внутрибрюшинный	Живая	6	1:16
		Инактивированная	6	1:13
	Интраназальный	Живая	6	1:21
		Инактивированная	6	1:5
Кролики	Внутрибрюшинный	Живая	3	1:60
		Инактивированная	3	1:5

Из таблицы 3 видно, что в группе морских свинок, зараженных внутрибрюшинным методом, на 30 сутки средний титр хламидийных антител был равен 1:16. В группе морских свинок, инфицированных интраназально, этот показатель был чуть выше и равнялся среднему титру 1:21. В группах морских свинок, которым вводили инактивированные суспензии из штамма «АМК-16» внутрибрюшинным и интраназальным методами средние титры специфических антител были равны 1:13 и 1:5 соответственно.

В группе кроликов, инфицированных внутрибрюшинным методом, средний титр комплементсвязывающих антител на 30 сутки равнялся 1:60. В группе кроликов, которым вводили инактивированную суспензию, средний титр был равен 1:5.

Таблица – 4 Результаты изучения иммуногенности штамма хламидий «АМК-16» на белых мышах

Номер группы	Штамм для иммунизации	Штамм для инфицирования	Животных пало/животны х всего	Процент выживших животных	Индекс защиты
1	«АМК-16»	«АМК-16»	4/20	80%	3,2
2	Контроль		13/20	35%
3	«АМК-16»	«РС-85»	6/20	70%	2,3
4	Контроль		14/20	30%
5	«АМК-16»	«250»	8/20	60%	1,8
6	Контроль		15/20	25%
7	«АМК-16»	«Ростиново-70»	5/20	75%	2,4
8	Контроль		12/20	40%
Средний индекс защиты по всем группам					2,4

В таблице 4 представлены результаты оценки иммуногенности штамма хламидий «АМК-16».

Как видно из таблицы 4, в группах животных, где первая группа была иммунизирована штаммом «АМК-16», а вторая – контрольная, после заражения штаммом «АМК-16», индекс защиты составил 3,2. В третьей и четвертой группах животных, составленных по тому же принципу, но инфицированных штаммом «РС-85», индекс защиты равнялся 2,3. В пятой и шестой группах, заражение которых проводили штаммом хламидий «250», был зафиксирован наименьший показатель индекса защиты, который ровнялся 1,8. В последних двух группах, зараженных штаммом хламидий «Ростиново – 70», индекс защиты составил 2,4. Средний индекс защиты по всем группам был равен 2,4.

Так, установлено, что наибольший процент гомологии у штамма «АМК-16» наблюдался со штаммом «Ростиново-70». Со штаммами «250» и «РС-85» установлен наименьший процент антигенной гомологии, что говорит о различии в антигенной структуре этих штаммов со штаммом «АМК-16».

В таблице 5 представлены результаты исследований антигенной активности экспериментального вакцинного препарата на основе штамма «АМК-16».

Таблица 5 – Результаты изучения антигенной активности экспериментального вакцинного препарата на основе штамма «АМК-16»

Номер животного	Вакцина на основе штамма	Способ введения	Титры антител в РСК
			30 сутки	60 сутки	90 сутки	120 сутки	150 сутки	180 сутки
1	«АМК-16»	В/М	1:160	1:80	1:80	1:40	1:40	1:20
2			1:80	1:80	1:40	1:20	1:10	1:10
3			1:80	1:40	1:80	1:40	1:40	1:20
4			1:160	1:320	1:80	1:80	1:80	1:40
Средние титры по группе			1:120	1:130	1:70	1:45	1:42	1:22,5

Как видно из результатов исследования, приведенных в таблице 5, на 30 сутки после введения вакцины средний титр хламидийных антител равнялся показателю 1:120. Максимальная концентрация специфических антител была выявлена на 60 сутки иммунизации и равнялась среднему титру 1:130. Далее концентрация антител в сыворотке крови морских свинок снижалась и на 90, 120, 150 и 180 сутки равнялась средним титрам 1:70; 1:45; 1:42 и 1:22 соответственно.

Заключение. Установлено, что штамм хламидий «АМК-16» является вирулентным для лабораторных животных, причем степень патогенности коррелируется в зависимости от способа инфицирования биологических моделей. Также было доказано, что новый штамм хламидий способен вызывать выработку специфических хламидийных антител и обладает высокой иммуногенной активностью, что открывает перспективу его дальнейшего использования в качестве производственного штамма при разработке средств специфической профилактики хламидийных инфекций.

вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»:

автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук / Евстифеев Виталий Валерьевич. – Казань, 2015. – 47 с.: ил. – Библиогр.: с 42– 47. – Место защиты: ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Резюме

Представлена характеристика иммунобиологических свойств зоонозного штамма хламидий «АМК-16», выделенного из патологического материала абортировавшей козы. В ходе исследований было установлено, что данный штамм является патогенным для лабораторных животных, вызывая 100 % гибель белых мышей при интраназальном способе заражения, 71,6 % – гибель при внутрибрюшинном инфицировании и 28,3 % – падеж мышей при подкожном введении. Аналогичные испытания на морских свинках показали, что штамм «АМК-16» наиболее патогенен при интраназальном способе введения инфекционного материала и вызывает гибель 25 % животных. Штамм «АМК-16» обладает выраженными антигенными свойствами и вызывает выработку специфических хламидийных антител у иммунизированных животных, причем наиболее результативный эффект активирующий деятельность гуморальной иммунной системы вакцинированных животных достигается в комплексе антигена с адъювантом. Изучение иммуногенности штамма «АМК-16» показало, что он способен вызывать выработку специфического иммунитета к хламидийным инфекциям у животных.