Иммуногистохимическое исследование дефекта челюстной костной ткани после проведения зубосохраняющих операций

Формирование хронического одонтогенного очага инфекции в организме часто приводит к удалению причинного зуба [1]. Существуют методики хирургических вмешательств, позволяющие сохранять зубы с воспалительно-деструктивными изменениями в периапикальных тканях, которые получили название зубосохраняющих операций . Однако во время оперативного вмешательства возникают дефекты костной ткани, которые могут привести к послеоперационным осложнениям. Одной из важнейших проблем хирургической стоматологии является оптимизация процессов регенерации костной ткани [2]. Высокая распространенность и трудности лечения деструктивных форм хронического 534

периодонтита обусловливают актуальность поиска новых и усовершенствования существующих методов лечения [3].

Для стимуляции остеогенеза большое значение имеют создание в костном дефекте депо из остеотропного материала и стабилизация в нем кровяного сгустка. Костеобразующие материалы тормозят активность остеокластов и, как следствие, уменьшают резорбцию костной ткани [4]. Также они ускоряют процессы новообразования и минерализации костной ткани [5].

Цель исследования – изучить клеточный состав послеоперационного дефекта челюсти для выбора оптимального остеопластического наполнителя для применения при зубосохраняющих операциях.

Материалы и методы

У 36 пациентов было проведено 32 гранулэктомии с резекцией верхушки корня (18 оперативных вмешательств – на верхней челюсти и 14 – на нижней). Во время оперативного вмешательства появлялся дефект ~ 180 мм³, который заполняли остеотропным материалом.

Все пациенты были разделены на 5 групп. 1 группа (8 пациентов) – контрольная; после проведения зубосохраняющей операции в ране организовывался кровяной сгусток. Во 2-й группе (8 пациентов) дефект костной ткани восполнялся аутогенной костной стружкой, полученной с помощью дрель-канюли из угла нижней челюсти во время операции; в 3-й (8 пациентов) – материалом «Аллоплант» (регистрационное удостоверение № 901 от 22.07.1987; производство ФГУ «Все-росийский Центр глазной и пластической хирургии Росздрава», г. Уфа), получаемым из трупной костной ткани человека; в 4-й (8 пациентов) – материалом «Остеоматрикс» (регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09830; производство ООО «Конектбиофарм», г. Москва). Источником данного биоматериала являются губчатые и кортикальные кости крупного рогатого скота, как правило, быков. В 5-й группе (4 пациента) проводилось исследование здоровой костной ткани. Материал был получен во время удаления ретинированных и дистопированных зубов по ортодонтическим показаниям.

Исследование материала проводилось на 3-й, 7-й, 30-й, 90-й, 120-й, 150-й, 180-й и 360-й день после операции. На 3-й и 7-й день слизистая оболочка на месте разреза еще не зажила и материал из раны получали с помощью кю-ретажной ложки. Начиная с 30-го дня проводили пункционную биопсию созревающей костной ткани с помощью иглы набора «Ostycut» («Bard», США).

Исследование срезов дефекта костной ткани проводилось с помощью иммуногистохимического метода.

Для выявления CD68 ⁺ -клеток в послеоперационном дефекте костной ткани челюсти использовались иммуногистохимические автостейнеры «Autostainer 360» («Thermo Scientific») и микроскоп «Leica DM4000B» («Leica Microsystems») с увеличением 400; материалом для исследования послужили моноклональные антитела к кластеру дифференцировки 68 типа (CD68⁺), клон ED-1 («Abcam», Великобритания), – маркер макрофагов.

Для выявления клеток, экспрессирующих маркер Ki-67, были использованы моноклональные антитела к маркеру клеточной пролиферации Ki-67, клон ММ-1 («NovoCastra», Великобритания) [6–7].

Для определения направленности и выраженности статистических изменений применялся Т-критерий Вилкок-сона. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Научное исследование проводилось в соответствии со стандартами этического комитета ФГБОУ ВО «ЧГУ им. И. Н. Ульянова» и пересмотренного варианта Хельсинкской декларации этических принципов (2008 г.).

Результаты исследования

В здоровой костной ткани челюсти при иммуногистохимическом окрашивании на CD68+-клетки было обнаружено очень низкий уровень концентрации макрофагов – 1 клетка на 2–3 поля зрения (рис. 1).

С помощью маркера Ki-67 была определена выраженность процессов пролиферации в здоровой челюстной костной ткани (рис. 2) и в дефекте костной ткани с применением различных остеотропных материалов. Результаты иммуногистохимической реакции Ki-67 отличались в группах исследования на различных сроках. Полученные данные были подтверждены результатами вычисления митотического индекса. Известно, что чем выше данный показатель, тем интенсивнее протекает новообразование костной ткани.

Р и с. 1. Здоровая костная ткань челюсти. Иммуногистохимическая реакция к CD68+

F i g. 1. Healthy bone tissue of the jaw. Immunohistochemical reaction for CD68+

Р и с. 2. Здоровая костная ткань челюсти. Иммуногистохимическая реакция к Ki-67. Заметны единичные клетки, экспрессирующие белок Ki-67

F i g. 2. Healthy bone tissue of the jaw. Immunohistochemical reaction to Ki-67. Single cells expressing protein Ki-67 are visible

На ранних сроках исследования материала дефекта челюсти с организацией в ране кровяного сгустка было обнаружено большое количество CD68+-клеток – 11–12 макрофагов на 1 поле зрения (рис. 3; табл. 1), а также клеток, экспрессирующих белок Ki-67, ~ 70 % от общего количества (табл. 2). Морфологически они характеризуются овальной формой с разной степенью окраски ядер.

На 30-й день количество CD68+-клеток уменьшилось и составило в среднем 10 макрофагов на 1 поле зрения; количество клеток, экспрессирующих Ki-67, незначительно снизилось и составило 60,5 ± 2 % (рис. 9).

На 90-й день после операции количество CD68+-клеток составило ~7 клеток на 1 поле зрения (табл. 1); количество клеток, экспрессирующих Ki-67, – в среднем 47,1 ± 0,9 % (табл. 2).

На 120-й день количество CD68+-клеток составило 4–5 клеток на 1 поле зрения; количество клеток, экспрессирующих Ki-67, – 37 ± 1 % (Там же).

С 180-го дня количество CD68+-кле-ток стало схожим с количеством макрофагов в здоровой челюстной кости – не более 1 клетки на 2 поля зрения (табл. 1); также произошло снижение экспрессии белка Ki-67, и его значение приблизилось к аналогичному показателю в здоровой челюстной кости (табл. 2).

Р и с. 3. Иммуногистохимическая реакция к CD68+ (1). 7-й день после операции с организацией в ране кровяного сгустка

F i g. 3. Immunohistochemical reaction for CD68+ (1). 7th day after operation with the organization in the wound blood clot

Р и с. 4. Иммуногистохимическая реакция к Ki-67. 30-й день после операции с организацией в ране кровяного сгустка. Заметно большое количество клеток, экспрессирующих белок Ki-67

F i g. 4. Immunohistochemical reaction to Ki-67. Material received on 30th day after operation with organization of blood clot in the wound. A large number of cells expressing Ki-67 protein are visible

В послеоперационном периоде с применением в дефекте челюсти аутогенной костной стружки количество CD68+-клеток на ранних сроках исследования колебалось от 3–5 клеток на 1 поле зрения (Рис. 5); количество клеток, экспрессирующих Ki-67, на 3-й день составило 42,9 ± 2,1%, а на 7-й день произошло статистически значимое ее увеличение – 46,8 ± 2,2% (табл. 2).

На 30-й день исследования количество CD68+-клеток составило в среднем 2 клетки на 1 поле зрения; количество пролиферирующих клеток уменьшилось до 36 ± 1 % (рис. 7; табл. 2).

На 90-й день после операции в материале дефекта костной ткани с применением аутогенной костной стружки количество CD68+-клеток достоверно стало соответствовать количеству данных клеток в здоровой костной ткани челюсти – 1 клетка на 2 поля зрения. На более поздних сроках исследования ситуация не претерпела серьезных изменений (табл. 1). Количество пролиферирующих клеток достигло значения показателей здоровой челюстной костной ткани; в последующих исследованиях данный показатель сохранял стабильность (табл. 2).

Р и с. 5. Аутогенная костная стружка в дефекте челюсти. 7-й день после операции. Иммуногистохимическая реакция к CD68+ (1)

F i g. 5. Autogenous bone chips in a jaw defect. 7th day after operation.

Immunohistochemical reaction for CD68+ (1)

Р и с. 6. Иммуногистохимическая реакция, выявляющая маркер Ki-67. 30-й день после операции с применением в дефекте аутогенной костной стружки.

Заметны клетки, экспрессирующие белок Ki-67

F i g. 6. Immunohistochemical reaction, identifying marker Ki-67. 30th day after operation using the defect with autologous bone chips. cells expressing protein Ki-67 are visible

На 3-й и 7-й день после проведения зубосохраняющей операции с применением в дефекте костной ткани материла «Аллоплант» количество CD68+-клеток составило ~ 6 клеток на 1 поле зрения (табл. 1). Было замечено, что макрофаги рассасывают остеотропный материал, в который прорастает соединительная ткань. Экспрессия Ki-67 незначительно снизилась, но осталась высокой – 49 ± 1 % (табл. 2).

На 90-й день было обнаружено снижение количества CD68+-клеток до

3-х на 1 поле зрения (рис. 7); экспрессия Ki-67 клеток также снизилась и составила 34,5 ± 1,5 % (табл. 2).

На 120-й, 150-й, 180-й и 360-й дни после операции количество макрофагов составило в среднем 1 клетку на 2 поля зрения (табл. 1). Данный показатель соответствует содержанию макрофагов в здоровой челюстной костной ткани. Кроме этого, произошло статистически значимое уменьшение экспрессии Ki-67 до показателей здоровой челюстной кости – 25 ± 1 % (рис. 8).

Р и с. 7. Материал «Аллоплант» в дефекте челюстной кости. 90-й день после операции. Иммуногистохимическая реакция к CD68+. 1 – остеотропный материал;

2 – единичные CD68+-клетки

F i g. 7. Material Alloplant in the defect of the jawbone. 90th day after operation. Immunohistochemical reaction for CD68+. 1 – оsteotropic material; 2 – single CD68+cells

На ранних сроках исследования материала «Остеоматрикс» обнаружены CD68+-клетки; в среднем заметно 10–11 макрофагов на 1 поле зрения (рис. 9). Количество клеток, экспрессирующих Ki-67, составило ~ 58 % (табл. 2).

На 30-й день количество CD68+-клеток уменьшилось и составило

8 клеток на 1 поле зрения (табл. 1); количество клеток, экспрессирующих Ki-67, достигло 50,0 ± 0,5 % (табл. 2).

На 90-й день количество CD68+-клеток уменьшилось и составило 6 клеток на 1 поле зрения; количество клеток, экспрессирующих Ki-67, достигло 42,8 ± 1,2 % (Там же).

Р и с. 8. Иммуногистохимическая реакция, выявляющая маркер Ki-67. 120-й день после операции с применением в дефекте материала «Аллоплант». Клетки, экспрессирующие белок Ki-67, практически отсутствуют

F i g. 8. Immunohistochemical reaction identifying marker Ki-67. 120th day after operation using the defect material Alloplant. Cells expressing Ki-67 protein are absent

Р и с. 9. Препарат «Остеоматрикс» в дефекте челюстной кости. 7-й день после операции. Иммуногистохимическая реакция к CD68+

F i g. 9. Medicament Osteomatrix in the defect of the jawbone. 7th day after operation. Immunohistochemical reaction for CD68+

На 120-й день после операции было обнаружено небольшое количество макрофагов – 2 клетки на 1 поле зрения (табл. 1); количество клеток, экспрессирующих Ki-67, снизилось до 33,3 ± 0,7 % (рис. 10).

На 150-й, 180-й и 360-й дни количество макрофагов не превышало

1 клетки на 2 поля зрения, что соответствует аналогичному показателю в материале здоровой костной ткани (табл. 1); количество клеток, экспрессирующих Ki-67, составило 26 ± 1 %, что схоже с экспрессией Ki-67 в здоровой челюстной кости (табл. 2).

Р и с. 10. Иммуногистохимическая реакция, выявляющая маркер Ki-67. 120-й день после операции с применением в дефекте препарата «Остеоматрикс». Клетки, экспрессирующие белок Ki-67, практически отсутствуют

F i g. 10. Immunohistochemical reaction, identifying marker Ki-67. 120th day after operation using medicament Osteomatrix. Cells expressing Ki-67 protein are absent

Обсуждение и заключения

В дефекте челюстной костной ткани на ранних сроках исследования количество CD68+-клеток достигало максимума. Увеличение данного показателя свидетельствует об усилении иммунного процесса и, следовательно, появлении гибнущих лимфоцитов. В дальнейшем количество CD68+-клеток приближается к аналогично-

му показателю в здоровой костной ткани. На 90-й день после операции это происходит в дефекте челюстной костной ткани с применением аутогенной костной стружки; на 120-й день – материала «Аллоплант»; на 150-й – материала«Остеоматрикс». Дольше всего данный процесс проходил в группе с организацией в дефекте кровяного сгустка (табл. 1).

Т а б л и ц а 1

T a b l e 1

Динамика распределения иммунокомпетентных клеток (CD68+ – маркер макрофагов) дефекта костной ткани после зубосохраняющих операций с применением различных остеотропных материалов

Dynamics of immunocompetent cells distribution (CD68+ macrophage marker) of bone defect after toothprotecting operations using different osteotropic materials

Сроки / Date Группы / Groups	3-й день / 3 rd day	7-й день / 7 th day	30-й день / 30th day	90-й день / 90th day	120-й день / 120th day	150-й день / 150th day	180-й день / 180th day	360-й день / 360th day
1 группа (контрольная) / Group 1 (Control)	12,42 ± 1,53	11,02 ± 1,16*	10,02 ± 0,95	7,52 ± 0,87	5,35 ± 0,53	3,12 ± 0,56*	0,63 ± 0,21	0,76 ± 0,23
2 группа (аутоген. кость) / Group 2 (autogenous bone)	4,24 ± 1,02	3,55 ± 0,54	2,14 ± 0,57	0,82 ± 0,44*	0,76 ± 0,23	0,94 ± 0,21	0,87 ± 0,21	0,73 ± 0,35
3 группа («Аллоплант») / Group 3 (Alloplant)	9,15 ± 1,03	6,53 ± 0,88 *	5,95 ± 0,61	3,06 ± 0,86	0,82 ± 0,17*	0,75 ± 0,13	0,62 ± 0,25	0,61 ± 0,27
4 группа («Остеоматрикс») / Group 4 (Osteomatrix)	11,03 ± 1,36	10,43 ± 1,27	8,52 ± 1,14	6,54 ± 0,71	2,53 ± 0,96	0,93 ± 0,76*	0,84 ± 0,92	0,82 ± 0,76

Примечание: * – статистически достоверное изменение показателя (p < 0,05). Количество клеток указано на 1 поле зрения. Количество наблюдений – 10 / Note: * – statistically significant change of index (p < 0,05). The number of cells is indicated on one field of view. Number of observations – 10

Известно, что в формировании костной ткани участвуют биологически активные вещества белковой природы. Иммуногистохимическая реакция с антителами к маркеру клеточной пролиферации Ki-67 позволяет идентифицировать и давать количественную оценку уровня экспрессии таких веществ [8–10]. Активаторные субъединицы (циклины) регулируют митотическое деление клетки на различных стадиях. Следовательно, выявленная положи-

тельная реакция отражает цикличность процессов сборки и разборки макромолекулярного комплекса в процессе каждого клеточного цикла.

Маркер Ki-67 способен косвенно определять скорость деления клеток. Следовательно, выявленная положительная реакция в дефекте костной ткани после зубосохраняющих операций с применением различных остео-тропных материалов указывает на скорость созидания клеточных элементов.

Т а б л и ц а 2

T a b l e 2

Экспрессия Ki-67 в клетках послеоперационного дефекта костной ткани челюсти, % The expression of Ki-67 in cells of the postoperative bone defect jaw, %

Сроки / Date Группы / Groups	3-й день / 3rd day	7-й день / 7th day	30-й день / 30th day	90-й день / 90th day	120-й день / 120th day	150-й день / 150th day	180-й день / 180th day	360-й день / 360th day
1 группа (контрольная) / Group 1 (Control)	70,13 ± 1,24	71,32 ± 1,45	60,53 ± 2,17	47,12 ± 0,96	37,21 ± 1,53*	32,63 ± 1,46	25,12 ± 0,94	24,53 ± 0,55
2 группа (аутоген. кость) / Group 2 (autogenous bone)	42,91 ± 2,16	46,85 ± 2,22*	36,33 ± 1,27	26,32 ± 0,75	26,12 ± 0,91	25,22 ± 1,66*	24,32 ± 1,26	25,22 ± 0,85
3 группа («Аллоплант») / Group 3 (Alloplant)	54,63 ± 2,47	54,56 ± 2,53	49,45 ± 1,56	34,51 ± 1,53	25,38 ± 1,42*	26,91 ± 1,31	25,42 ± 0,66	25,35 ± 0,77
4 группа («Остеоматрикс») / Group 4 (Osteomatrix)	59,52 ± 1,17	58,81 ± 1,26	50,21 ± 0,57	42,85 ± 1,22	33,33 ± 0,76	26,22 ± 1,55*	25,41 ± 1,56	25,12 ± 1,54

Примечание: * – статистически достоверное изменение показателя (p < 0,05). Количество клеток указано на 1 поле зрения. Количество наблюдений – 10 / Note: * – statistically significant change of index (p < 0,05). The number of cells is indicated on one field of view. Number of observations – 10

В процессе исследования было зарегистрировано непрерывное уменьшение митотического индекса. Максимальное количество клеток, экспрессирующих белок Ki-67, было замечено на ранних сроках исследования в группе с применением в дефекте кровяного сгустка (70,1 ± 1,2 %); меньшее – в дефекте костной ткани с применением материалов «Остеоматрикс» (59,5 ± 1,0 %) и «Аллоплант» (54,6 ± 2,4 %) (табл. 2). Таким образом, в послеоперационном периоде происходит увеличение пролиферативной активности клеток.

На ранних сроках исследования клеточные популяции в дефекте костной ткани находились в состоянии ак-

тивной пролиферации; впоследствии ее интенсивность снизилась (Там же).

Применение аутогенной костной стружки, полученной во время операции, сокращало срок новообразования костной ткани более чем в 2 раза, и в основном завершалось к 90-му дню послеоперационного периода.

На более поздних сроках наблюдалось снижение количества клеток, экспрессирующих Ki-67. На 90-й день после операции с применением в дефекте челюсти аутогенной костной стружки митотический индекс составил 26,3 ± 0,7 %, что приближено к значению аналогичного показателя в здоровой костной ткани. На 120-й

день статистически значимо похожая ситуация наблюдалась в дефекте костной ткани с применением материала «Аллоплант» (25 ± 1 %); к 150-му дню – материала «Остеоматрикс» (26 ± 1 %). На 180-й день после операции с применением в дефекте кровяного сгустка индекс пролиферации сни-

зился до значений здоровой челюстной костной ткани (25,1 ± 0,9 %) (Там же).

Таким образом, наибольшая вероятность полноценного восстановления дефекта костной ткани после зубосохраняющих операций возможна при применении аутогенной костной стружки.