Иммунологический мониторинг в ветеринарии. Тенденции развития, возможности и реальность

Интерес к проблеме иммунологического мониторинга обусловлен прежде всего тем, что почти любая патология является причиной или следствием иммунологических нарушений, которые способствуют развитию хронической формы основного заболевания или его осложнениям. Иммунная система — одна из важнейших гомеостатических систем организма, которая во многом определяет здоровье животных и их адаптивные возможности; она является индикаторной системой экологического неблагополучия и чутко реагирует на изменения окружающей среды. В силу высокой чувствительности иммунная система выступает как показатель воздействия на организм антропогенных факторов. Нарушение функции иммунной системы рассматривается как один из патогенетических механизмов любого патологического процесса (1).

Иммунологический мониторинг проводят для оценки функционального состояния иммунной системы, влияния на иммунный статус различных неблагоприятных факторов, а также идентификации нарушенного звена при первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях. Главным проявлением иммунодефицита является повышенная восприимчивость к инфекционным заболеваниям. В антиинфекци-онной защите принимают участие три системы: фагоцитоз, В- и Т-системы иммунитета. Для оценки эффекторных функций основных компонентов такой защиты у людей предложен двухэтапный системно-функциональный подход, который в полной мере приемлем для иммунологического мониторинга различных популяций животных (2, 3). Двухуровневая оценка иммунного статуса обеспечивает возможность не только выявления дефицита по отдельным звеньям иммунной системы, но и дает возможность оценить иммунотерапевтическую и иммунокорригирующую эффективность применения иммуномодулирующих препаратов. Последнее обстоятельство является особо значимым, так как на рынке появляется все больше ветеринарных препаратов, рекомендуемых в качестве иммуномодуляторов.

При оценке иммунного статуса на первом этапе с помощью более простых методов, или тестов первого уровня, выявляют нарушения фагоцитоза, дефекты различных звеньев иммунной системы (4, 5). При этом нарушения фагоцитоза анализируют по абсолютному числу нейтрофилов и моноцитов, а также функциональному состоянию фагоцитов (выявление активных форм кислорода, способность нейтрофилов и моноцитов поглощать и убивать микроорганизмы).

Для оценки Т-системы иммунитета определяют следующие показатели: абсолютное и относительное число лимфоцитов в периферической крови; абсолютное и относительное число зрелых Т-лимфоцитов (CD3), хелперов/индукторов (СD4) и цитотоксиче- ских лимфоцитов (СD8); пролиферативный ответ на основные Т-митогены (фитогемагглютинин и конкавалин А).

Для характеристики В-системы иммунитета проводят количественное определение в сыворотке крови иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgM, IgA), а также рассчитывают абсолютное и относительное число В-лимфоцитов (CD19, CD20).

С целью более тщательного анализа функционирования иммунной системы используют тесты второго уровня: при выявлении фагоцитарных нарушений определяют миграционную активность фагоцитов и экспрессию на мембране нейтрофилов молекул адгезии (CD11a, CD11b, CD11c, CD18); при оценке Т-системы — продукцию цитокинов (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN, TNF и др.), наличие активационных молекул на поверхностной мембране Т-лимфоцитов (CD25, антигены главного комплекса гистосовместимости — MHC) и молекул адгезии (CD11a, CD18), пролиферативный ответ на специфические антигены, а также тесты с рядом микробных антигенов; при оценке В-системы — концентрацию иммуноглобулинов (IgG и sIgA), соотношение Ж - и Х -цепей, наличие специфических антител, а также способность лимфоцитов давать пролиферативный ответ на Т- и В-митогены.

Идентификация нарушенного звена иммунитета и оценка характера этого нарушения позволяют диагностировать иммунодефицитные состояния, лежащие в основе большинства патологических процессов. Эксперты ВОЗ в настоящее время рекомендуют применять наиболее информативные и современные методы оценки иммунного статуса животных, которые включают иммунохимический анализ, клеточные и иммуногенетические тесты (6). Среди иммунохимических методов следует выделить количественное определение иммуноглобулинов, иммунных комплексов, цитокинов, компонентов комплемента, белков, образующихся на острой стадии развития заболевания. Исследования должны включать оценку количества субпопуляций лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов и других эффекторных клеток, функциональной активности макрофагов и нейтрофилов, а также иммуногистологи-ческий анализ. Иммуногенетические исследования проводят с целью типирования антигенов главного комплекса гистосовместимости, определения аллотипов сывороточных белков (как по фенотипам, так и генотипам), выявления генетически детерминированных дефектов иммунной системы. Благодаря совершенствованию методов иммунологического анализа появилась возможность диагностировать у животных генетически обусловленный и приобретенный иммунодефицит, что позволяет правильно выбирать стратегию иммунокорригирующей терапии и профилактики (7).

В последние годы возрос интерес исследователей и специалистов- практиков к проблеме иммунодефицита у животных, так как последнему сопутствуют различные патологические процессы, в том числе инфекционные заболевания, вызываемые вирусами, бактериями, грибами и простейшими (8). Термином иммунодефицит принято обозначать нарушения иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа. По происхождению и механизмам развития различают первичный и вторичный иммунодефицит. В основе иммунологической недостаточности первичного происхождения лежит генетически обусловленная неспособность организма реализовать то или иное звено эффективного иммунного ответа.

Первичный иммунодефицит считается врожденным, так как проявляется вскоре после рождения, имеет четко выраженный наследственный характер и, как правило, наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Особый интерес для клинической ветеринарной иммунологии представляет вторичный иммунодефицит, который встречается чаще, носит приобретенный характер и обусловлен воздействием на организм вирусов, бактерий, паразитов, а также нарушением обмена веществ. Вто ричный иммунодефицит может возникать при воздействии цитотоксических препаратов и ионизирующей радиации. Наиболее распространенная форма вторичной иммунологической недостаточности у животных обусловлена нарушениями процессов передачи антител от матери потомству, что провоцирует высокую заболеваемость и смертность новорожденных. Несвоевременность и неадекватность получения молозива приводят к развитию у новорожденных телят иммунодефицитных состояний, на фоне которых развиваются различные патологические процессы.

В зависимости от степени и локализации нарушений различают следующие формы иммунодефицита: гуморальный (нарушения В-системы); клеточный (преимущественно дефекты Т-системы); комбинированный, сопровождающийся поражением клеточного и гуморального звеньев иммунитета.

У крупного рогатого скота среди первичных форм иммунодефицита зарегистрированы комбинированный, синдром Чедиака-Хигаши, селективный IgG2-дефицит, наследственный паракератоз (А-46) и дефицит адгезии лейкоцитов (BLAD) (9, 10).

Комбинированный иммунодефицит выявлен у телят ангусской породы. При этом животные рождаются клинически здоровыми, однако в 6-недельном возрасте у них развиваются пневмония и диарея, наблюдаются лимфопения и выраженная гипо-гаммаглобулинемия. В сыворотке крови таких животных отсутствуют IgM и IgA, концентрация IgG существенно снижается. Гибель наступает в течение 1 нед; у павших особей обнаруживаются гипоплазия тимуса и селезенки, атрофия лимфатических узлов.

Селективный IgG2-дефицит был зарегистрирован у особей красного датского скота: у 1-2 % животных отсутствовал иммуноглобулин этого субкласса, что провоцировало развитие пневмонии и гангренозного мастита. В популяции этой породы у 15 % животных отмечена низкая концентрация IgG2 в крови, причем клинических признаков заболевания не наблюдалось.

Наследственный паракератоз (Т-клеточный дефицит) описан у чернопестрого, датского, фризского и голштинского скота как аутосомно-рецессивный признак, проявляющийся в гипоплазии тимуса и клеток лимфоидной системы. При этом было выявлено изменение функциональной активности Т-клеток и снижение клеточного иммунитета; животные слабо реагировали на введение туберкулина. У больных особей рождались здоровые телята, но через 4-8 нед у последних появлялись поражения кожи в виде глубоких дерматитов, и они погибали в возрасте до 4 мес с признаками экзантемы, паракератоза вокруг рта и глаз; у павших телят отсутствовал волосяной покров на конечностях, наблюдалась атрофия тимуса, селезенки и лимфатических узлов.

В основе синдрома Чедиака-Хигаши лежит дефект гена LYST, который кодирует полипептид, регулирующий внутриклеточный транспорт белков. Этот синдром обнаружен у крупного рогатого скота герефордской, брангусской и японской черной пород и является врожденным, так как возникает в результате аутосомнорецессивной мутации. Заболевание характеризуется поражением клеток, содержащих цитоплазматические гранулы: нарушается формирование фаголизосом в нейтрофилах, хемотаксис, функция цитотоксических Т- и NK-клеток; в моноцитах, нейтрофилах и базофилах появляются увеличенные цитоплазматические гранулы, вследствие чего нарушается функциональная активность этих клеток и снижается способность к внутриклеточному микробиальному киллингу. У животных при этом проявляется повышенная чувствительность к бактериальным инфекционным болезням. Описаны случаи развития генерализованной гипопигментации глаз и кожи (кожно-глазной альбинизм), светобоязни и изменения окраски волосяного покрова животных. Диагноз может быть поставлен на основании анализа окрашенных мазков перифериче- ской крови при обнаружении у больных особей очень крупных гранул в лейкоцитах или увеличении размера гранул меланина в волосяном покрове.

Серьезную экономическую проблему в животноводстве представляет врожденный иммунодефицит крупного рогатого скота — дефицит адгезии лейкоцитов (BLAD). Впервые это генетически детерминированное заболевание обнаружено у телят голштинской породы — прямых потомков знаменитого американского быка, сперму которого широко использовали для осеменения коров в 50-60-е годы прошлого столетия. Дефектный ген, который наследуется по аутосомно-рецессивному типу, быстро распространился среди крупного рогатого скота голштинской породы, и в последнее десятилетие заболевание вызывает наибольшие опасения. BLAD-синдром связан с точечной мутацией в кодирующей части аутосомного структурного гена CD18 , контролирующего синтез гликопротеина В-интегрина — белка оболочки клеток нейтрофилов. При этом цитозин заменяется на гуанин, а остаток аспарагиновой кислоты — на глицин, в результате чего не происходит образования функционально активного интегрина CD11b/CD18, и нейтрофилы теряют способность прикрепляться к эндотелию кровеносных сосудов и мигрировать к местам воспаления. У животных, имеющих дефектный ген, понижается естественная резистентность к бактериальным и грибковым болезням, в мягких тканях преобладают некротические и гангренозные процессы, снижается интенсивность роста и развития, и обычно они погибают в возрасте от 2 до 7 мес. На сегодня частота распространения дефектного гена CD18 в популяциях крупного рогатого скота голштинской породы составляет в США среди быков и коров соответственно 15-17 и 6 %. Частота встречаемости BLAD-синдрома в Дании, Германии, Франции, Польше, Чехии, Украине и России составляет соответственно 22,6; 6,4; 6,0; 5,0; 4,0; 4,0 и 5,7 % (11-13). В Россию дефектный ген поступил в результате импорта семени от носителей BLAD из США, Канады и Германии. Для борьбы с этим заболеванием необходимо разработать Национальную программу по выявлению носителей иммунодефицита и элиминации их из селекционного процесса по примеру ряда зарубежных стран (США, Дания, Германия). Такую работу в России проводят во Всероссийском НИИ животноводства, используя для выявления дефектного гена CD18 полимеразную цепную реакцию.

Одним из наиболее изученных первичных иммунодефицитов в ветеринарии является комбинированный иммунодефицит арабских жеребят, который наследуется также по аутосомно-рецессивному типу и характеризуется полным отсутствием у животных зрелых Т- и В-лимфоцитов. Около 26 % арабских лошадей имеют ген, обусловливающий эту форму иммунологической недостаточности, и около 3 % жеребят — носителей гена погибают в возрасте до 5 мес. Диагноз ставят на основании низкого количества или отсутствия лимфоцитов в крови, гипоплазии первичных и вторичных лимфатических органов и отсутствия IgM в сыворотке крови жеребят до приема молозива. Никаких эффективных средств иммунотерапии этой патологии нет, а профилактика направлена на выявление иммунологической недостаточности и исключение из воспроизводства особей, среди потомства которых рождаются жеребята с комбинированным иммунодефицитом.

Диагностику иммунодефицита проводят по качественной и количественной оценке различных звеньев иммунной системы, а также иммунорегуляторных механизмов, с помощью которых осуществляется созревание, дифференцировка и взаимодействие Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток, иммуноглобулина и комплемента. Для идентификации нарушенного звена иммунитета, особенно при врожденной иммунологической недостаточности, применяют сложный комплекс лабораторных исследований, включающих иммунологические, биохимические и молекулярно-генетические методы.

Определение количества и функциональной активности Т-клеток и их основных субпопуляций является одним из главных методов оценки Т-системы имму-6

нитета и диагностики всех форм иммунодефицита, связанных с нарушением клеточного иммунитета. При этом необходимо определять общее число лимфоцитов, долю и абсолютное количество зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и их основные субпопуляции: Th(CD4), Tc/Ts(CD8). При оценке В-системы иммунитета важнейшими показателями являются: доля и абсолютное количество В-лимфоцитов (CD19, CD20), а также концентрация продуцируемых ими иммуноглобулинов G-, M- и A-классов.

Определение концентрации иммуноглобулина является важнейшим критерием при диагностике иммунодефицита, связанного с биосинтезом антител. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов необходимо определять их абсолютное число, интенсивность поглощения бактерий, способность к киллингу и разрушению, а также интенсивность хемотаксиса фагоцитов. Диагностика у телят вторичной иммунологической недостаточности, обусловленной несвоевременным и неадекватным получением молозива, основана на определении концентрации сывороточных иммуноглобулинов. С этой целью используют пробирочный тест с сульфитом натрия, различные экспресс-методы, а также метод радиальной иммунодиффузии (РИД) для определения концентрации иммуноглобулинов отдельных изотипов.

Исследования, проводимые в последние годы во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, неразрывно связаны с разработкой и совершенствованием иммунологических методов по оценке иммунного статуса животных и иммунологического мониторинга различных популяций. Нами усовершенствованы методы определения концентрации иммуноглобулинов в биологических жидкостях у крупного рогатого скота, овец и свиней на основе радиальной иммунодиффузии и различных вариантов иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноспецифи-ческих антисывороток и моноклональных антител к отдельным изотипам иммуноглобулина; разработан ELISPOT-метод (точечный ИФА) для количественного определения антителосекретирующих клеток в центральных и периферических органах иммунной системы, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (14, 15). На основе использования этого метода и его вариантов появляется возможность проводить исследования фундаментального характера, направленные на выявление механизмов формирования и регуляции иммунного ответа, роли отдельных органов иммунной системы в процессе иммуногенеза, а также позволяющие оценивать иммунологическую эффективность различных вакцинных препаратов традиционного характера, субъединичных и ДНК-вакцин.

Методология оценки иммунного статуса и мониторинга различных популяций животных предполагает необходимость стандартизации и унификации методов лабораторных иммунологических исследований при условии их высокой информативности. К сложностям практического характера по осуществлению иммунологического мониторинга следует отнести также слабую материально-техническую базу, отсутствие методов оценки иммунитета отдельных видов животных и нормативных показателей для каждой популяции. В этом плане широкие возможности открываются при использовании метода проточной цитометрии, который позволяет проанализировать практически все параметры иммунной системы. Отсутствие отечественного проточного цитометра сдерживает исследования по широкомасштабному иммунологическому мониторингу различных популяций животных. Развитие как фундаментальной, так и прикладной иммунологии требует дальнейшего совершенствования методов иммунологического анализа, включая молекулярно-генетические, накопления новых данных и оценки интегральных показателей (в норме и при иммунопатологии), а также математических подходов к этой проблеме. От степени развития ветеринарной иммунологии сегодня зависит прогресс в области создания новых методов диагностики, иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекционных и инвази- онных болезней животных, понимание механизмов развития любого патологического процесса.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    М а н ь к о В.М., П е т р о в Р.В., Х а и т о в Р.М. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы. Иммунология, 2002, 3: 132-138.

• 2.    П е т р о в Р.В., К о в а л ь ч у к Л.В., Ч е р е д е е в А.Н. и др. Оценка иммунного статуса человека. Метод. реком. М., 1984.

• 3.   П е т р о в Р.В., Х а и т о в Р.М., П и н е г и н Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и

  при патологии. Иммунология, 1984, 1: 6-9.

• 4.   П е т р о в Р.В., Х а и т о в Р.М., М а н ь к о В.М. и др. Оценка иммунного статуса, иммунологиче

  ский мониторинг — современные проблемы клинической иммунологии и аллергологии. Иммунология, 1994, 6: 4-9.

• 5.   П е т р о в Р.В., Х а и т о в Р.М., П и н е г и н Б.В. Иммунодиагностика иммунодефицитов. Имму

  нология, 1997, 4: 4-7.

• 6.   Х а и т о в Р.М., П и н е г и н Б.В., Ч е р е д е е в А.Н.. Оценка иммунной системы человека: совре

  менное состояние вопроса, сложности и достижения. Иммунология, 1998, 6: 8-10.

• 7.   Х а и т о в Р.М., П и н е г и н Б.В., И с т а м о в Х.И. Экологическая иммунология. М., 1995.

• 8.   Ф е д о р о в Ю.Н., В е р х о в с к и й О.А. Иммунодефициты домашних животных. М., 1996.

• 9.   Н a l i w e l l R.E.W., G o r m a n N.T. Veterinary Clinical Immunology, 1989: 449-466.

• 10.  T i z a r d I.R. Veterinary Immunology. An Introduction, 2000, Six edition,- 482 p.

• 11.    И г н а т ь е в В.М. Скрининг гена лейкоцитарной адгезии (BLAD-синдром) у животных чернопестрого корня крупного рогатого скота. Автореф. канд. дис. Дубровицы, 1998.

• 12.    Г л а з к о В.И., Ф и л е н к о А.Н. Динамика распространения мутации BLAD (иммунодефицит) у крупного рогатого скота. Докл. РАСХН, 1999, 2: 41-43.

• 13.    Г л а з к о В.И., Л а в р о в с к и й В.В., Ф и л е н к о А.Н. и др. Внутрипородная генетическая дифференциация и наличие мутации BLAD у крупного рогатого скота голштинской породы. С.-х. биол., 2000, 4: 45-48.

• 14.    Ж д а н о в А.И., В е р х о в с к и й О.А., Ф е д о р о в Ю.Н. Разработка ELISPOT-метода для определения специфических антителосекретирующих клеток. Мат. науч.-практ. конф. Воронеж, 1999: 206-208.

• 15.    Ф е о к т и с т о в а Т.А., Е з д а к о в а И.Ю., Ф е д о р о в Ю.Н. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Щелково, 2000: 279-281.

Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, 109472, Москва, Кузьминки