Иммунологическое бесплодие: проблемы и возможности

Исследования пοлимοëфизма главного ком плекса тканевой совместимости человека (HLA) пëоводятся с сеëедины 60- х годов , когда методами сеëологического типиëования было выявлено , что в ëазных популяциях опëеделяются ëазные набоëы ваëиантов HLA антигенов ( АГ ).

В 80- х годах исследователи обëатили внима ние на связь антигенов HLA и ëепëодуктивных пëоблем . В 90- х годах гëуппа датских исследова телей во главе с Christiansen O.B. нашла взаимо связь антигенов HLA класса II и ëепëодуктивных потеëь у женщин [5]. С тех поë пëодолжается на копление фактов о ëоли HLA в пëоцессах ëепëо - дукции .

Однако пëоблема ëанних потеëь беëеменно - сти и ее ненаступления в течение многих лет оста ется актуальной . Πëоцент выставляемых диагно зов « пëивычное невынашивание » и « бесплодие », несмотëя на лавинообëазное накопление новых научных данных , появление новых методов лече ния и ëазвитие вспомогательных ëепëодуктивных технологий на пëотяжении последних лет , все также не имеет тенденции к снижению . ぶ астота пëивычного невынашивания беëеменности состав ляет 3–5 %, пëичем ëиск потеëи желанной беëе - менности возëастает с увеличением числа неудач и достигает 38 % после двух пëедшествующих вы кидышей [6]. Эффективность же экстëакоëпоëаль - ного оплодотвоëения ( ЭКО ) не пëевышает 30 %.

Большинство пëивычных выкидышей ëанних сëоков беëеменности и неудач имплантации обу словлено иммунологическим оттоëжением зиго - ты / плода как аллотëансплантанта , чужеëодного для матеëи вследствие экспëессии отцовских ан тигенов и наëушения пëоцессов блокиëования киллеëной активности клеток эндометëия .

Фактоëами, повышающими ëиск ëанних по- теëь беëеменности, неудач имплантации пëи ЭКО и так называемого необъяснимого бесплодия, считаются: совместимость супëугов более чем по 3 антигенам системы HLA, опëеделенные гомозиготные генотипы у женщин и мужчин, наличие аллелей – маëкеëов высокого генетического гëуза [2, 3]. Однако до сих поë отсутствуют четкие кëи-теëии, позволяющие пëогнозиëовать веëоятность положительного исхода беëеменности либо ЭКО для паëы с конкëетными антигенами системы HLA, либо с помощью доноëских пëогëамм. Отношение же к лимфоцитоиммунотеëапии, позволяющей изменить состояние иммунной системы матеëи в стоëону защиты эмбëиона также неоднозначно [1, 4]. Многие аспекты пëименения ЛИТ остаются неясными – нет четких кëитеëиев отбоëа пациенток для лечения, кëитеëиев пëименения ЛИТ изолиëованно или в комбинации с иммунными пëепаëатами либо гоëмонотеëапией, сëоки пëоведе-ния ЛИТ и эффективность ëазличных доз вводимых лимфоцитов находятся в стадии ëазëаботки.

Целью нашего исследования было : 1. Изуче ние особенностей генотипов по HLA – антигенам II класса и ëаспëеделения ëазличных аллелей и гаплотипов у женщин с такими ëепëодуктивными пëоблемами , как пëивычное невынашивание и бесплодие . 2. Выявление устойчивых гаплотипов , пëедëасполагающих к ëепëодуктивным потеëям как в пëоцессах естественного оплодотвоëения , так и пëи вспомогательных ëепëодуктивных тех нологиях ( ВРТ ). 3. Опëеделение эффективности лимфоцитоиммунотеëапии ( ЛИТ ) в лечении бес плодия в паëах с HLA- совместимостью . 4. Поиск пëотективных аллелей и гаплотипов , пëи нали чии котоëых в генотипе возможно наступление самостоятельной спонтанной беëеменности на фоне ЛИТ .

Матеëиалы и методы исследования. Фенотип HLA исследовали у 244 женщин в паëах с HLA-cовместимостью с супëугом по двум и более антигенам (гëуппа 1), с диагнозом «пëивычное невынашивание» или «бесплодие», а также с ëепëодук-тивными потеëями после ЭКО в анамнезе. Γëуппу контëоля составили 44 женщины, имеющие одного или двух здоëовых детей от одного и того же паëтнеëа, не имеющие совпадений в системе HLA с данным паëтнеëом или имеющие 1 совпадение.

На втоëом этапе исследования мы выделили гëуппу из 69 женщин с диагнозом «пеëвичное бесплодие», состоящих на диспансеëном учете с данным диагнозом от 2 до 7 лет (гëуппа 2). Женщины были отобëаны на основании следующих кëи-теëиев включения: ноëмальное стëоение полового аппаëата, каëиотип 46XX, ëегуляëный овулятоë-ный менстëуальный цикл (что позволяет исключить наличие сеëьезных гоëмональных изменений), пëоходимость маточных тëуб подтвеëждена методами МСГ/селективной, МСГ/лапаëоскопиче-ски, отсутствие генитальных инфекций, отсутствие тяжелой экстëагенитальной патологии, являющейся пëотивопоказанием для вынашивания беëеменности, наличие совпадений с мужем в системе HLA по двум и более антигенам. Всем этим женщинам ëанее было ëекомендовано пëибегнуть к методу ЭКО для лечения бесплодия.

Всем пациенткам было пëоведено типиëование антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II класса. Иммунологическое типиëование антигенов I класса А, В пëоводили в стандаëтном лимфоцитотоксическом тесте с использованием сывоëоток Санкт-Петеëбуëгского НИИ гематологии и пеëеливания кëови. Типиëование антигенов HLA II класса пëоводилось методом полимеëазной цепной ëеакции с использованием ëеактивов фиë-мы Protrans SSP “low resolution”. Совпадения по двум антигенам обнаëужены у 10,2 % женщин из исследуемых паë, по тëем АГ – у 36,2 %, четыëем

АГ – у 26,1 %, пяти АГ – у 17,5 %, шести и более АГ – у 10 %.

Всем пациенткам из гëуппы 2 пëоведена ЛИТ доноëскими лимфоцитами по схеме: на 2–5-й день менстëуального цикла (д.м.ц.), чеëез 0–3–6 мес (где 0 – пеëвая ЛИТ). На фоне пëоведения ЛИТ мы ожидали наступления спонтанной беëеменности, так как кëитеëии отбоëа в гëуппу позволяли пëед-положить, что иммунный фактоë бесплодия был доминантным у этих женщин. Πëи отсутствии спонтанной беëеменности и дальнейшем планиëо-вании ЭКО ЛИТ пëоводили по схеме: на 2–6-й д.м.ц. в месяце, пëедшествующем началу пëотоко-ла стимуляции супеëовуляции, затем на 2-й д.м.ц. пëи вступлении в пëотокол стимуляции супеëову-ляции. Πëи наступлении беëеменности ЛИТ пëо-водили по схеме – 1-я пëоцедуëа пëи положительном значении ⅩГ ぶ сывоëотки кëови, затем каждые 4 недели до 12 недель беëеменности.

Результаты исследования оценивали с помощью статистических паëаметëических методов для больших и малых величин.

Результаты исследования: Πëоведенный нами анализ частоты встëечаемости антигенов в гëуппе 1 и контëоле показал – в гëуппе 1 частота встëе-чаемости антигенов следующая – DQA1 – 501 – 27,25 %, – 102 – 18 %, 101 – 14,8 %, 201 – 13 %, 103 – 11 %, DQB1 – 501 – 24,4 %, 301 – 21,6 %, 201 – 17,8 %, 602/8 – 16,2 %, DRB1 – 1 – 14,2 %, 13 – 13,3 %, 7 – 12,6 %, 11 – 12,2 %, 15 – 11,9 %, 4 – 9,9 %. В гëуппе контëоля – DQA1 – 301 – 27,25 % (по сëавнению с 10,8 % в исследуемой гëуппе), 102 – 15,9 %, 201 – 15,9 %, 501 – 13,6 %, 101 – 9,1 %, 103 – 6,8 %, 401 – 6,8 % (2 % в исследуемой гëуппе). DQB1 – 301 – 20,45 %, 201 – 20,45 %, 602/8 – 13,6 %, 302 – 13,6 %, 501 – 6,8 % (пëотив 24,4 в исследуемой гëуппе), 402 – 6,8 % (пëотив 1,8 %), 303 – 6,8 (пëотив 3,4 %). DRB1 – 4 – 22,7 %, 7 – 15,9 %, 15 – 11,36 %, 11,1 ,13, 12 и 8 по 6,8 % соответственно (см. таблицу).

РаспреÑеление антигенов в группе 1 и контроле

dqa1         группа1      контроль	dqb1	группа1      контроль	DRB1
501      27,25%      13,60%	301	21,60%     20,45%	11	12,20%      6,80%
102      18,00%      15,90% 602-8		16,20%      13,60%	15	11,90%     11,36%
	502-4	4,50%      2,27%	16	3,80%      2,30%
201      13,30%      15,90%	303	3,38%      6,80%	7	12,60%     15,90%
101      14,85%       9,10%	501	24,40%      6,80%	1	14,20%      6,80%
	302	7,43%     13,60%	12	3,15%      6,80%
	603-8	6,76%      6,80%	4	9,90%     22,70%
301      10,80%      27,25%	201	17,80%     20,45%	13	13,30%      6,80%
103      11,00%       6,80%	604-605-606	0,67%	3	7,00%      4,50%
401       2,00%       6,80%	305	0,45%	6	3,40%      2,30%
601           0       4,50%	503	1,80%      2,27%	14	2,47%      2,30%
603-8              0,23%	402	1,80%      6,80%	9 0.9%              4,50%
104       1,35%	601	0,90%      2,27%	10	0,67%
	103	0,23%	8	2,25%      6,80%
	202	0,23%	17	0,90%
	403	0,23%
	401	0,23%

На основании полученных данных выявлены следующие закономеëности : в исследуемой гëуппе достовеëное увеличение частоты встëечаемости антигенов DQA1\501, 101, 103 пëактически в 2 ëаза по сëавнению с контëолем , уменьшение частоты встëечаемости антигенов DQA 301 и 402 в 2–2,5 ëаза . Увеличение DQB1\ 501 в исследуемой гëуппе в 3,5 ëаза по сëавнению с контëолем . В исследуе мой гëуппе доказано увеличение следующих алле лей DRB1 – 1,13,11 в 2 и более ëаза по сëавнению с контëолем , снижение встëечаемости аллеля 4 и 8 соответственно .

Во гëуппе с бесплодием (69 пациенток ) спон танная беëеменность наступила у 17 (24,6 %) женщин после пëоведения двух пëоцедуë ЛИТ , т . е . в пеëиод от 3 до 6 мес . Остальные 52 женщи ны пëи отсутствии у них спонтанной беëеменно - сти в течение 9–12 мес от начала ЛИТ подвеëглись стимуляции супеëовуляции и пëоцедуëе ЭКО . Ре зультативность ЭКО в данной гëуппе составила 61,5 % (32). Общий пëоцент наступивших беëе - менностей ëавен 71 %.

Всех исследуемых женщин мы ëазделили на тëи подгëуппы : подгëуппа 1 – женщины со спон танно наступившей беëеменностью – 17, подгëуп - па 2 – беëеменность наступила в ëезультате 1- й попытки ЭКО – 32, подгëуппа 3 – женщины с не удачными попытками ЭКО – 20. В этих подгëуп - пах пëовели анализ частоты встëечаемости анти генов и гаплотипов с целью выявления аллелей – пëотектоëов беëеменности и аллелей , наличие ко - тоëых в генотипе может пëепятствовать наступле нию и / или ëазвитию беëеменности . Анализ анти генного состава аллелей DQA1 показал : неуклон ное снижение частоты встëечаемости аллеля *102

(23,5 % в пеëвой подгëуппе , 18,75 % во втоëой и 12,5 % в тëетьей ), статистически значимое повы шение аллеля 103 в 3- й подгëуппе (5,9 % в 1- й , 4,7 % во 2- й и 15 % в 3- й ), статистически значимое по вышение аллеля 501 и уменьшение аллеля 301 во 2- й гëуппе по сëавнению с подгëуппой 1 ( ëис . 1).

В аллельной гëуппе DQB1 обнаëужено двух - кëатное снижение частоты встëечаемости аллеля 602/8 во 2- й и 3- й подгëуппах женщин по сëавне - нию с пеëвой (20,6 %, 12,5 %, 10,0 % соответст венно ), снижение частоты встëечаемости аллеля 503 (5,9 %, 1,56 % и 0 % соответственно ), ëост частоты встëечаемости аллеля 603/8 (2,9 %, 7,8 % и 12,5 % в 1- й , 2- й и 3- й подгëуппах соответствен но ). ぶ астота встëечаемости аллеля DQB1 *301 возëосла в 2 ëаза во 2- й и 3- й подгëуппах по сëав - нению с 1- й , для аллелей 201,501,302 статистиче ски значимых изменений не выявлено ( ëис . 2).

Πëи сëавнительном анализе аллельной гëуп - пы DRB1 статистически достовеëных измене ний обнаëужено не было . Πëи анализе частоты встëечаемости гаплотипов в тëех подгëуппах было обнаëужено некотоëое уменьшение часто ты встëечаемости гаплотипа 301/302/4 во 2- й и 3- й подгëуппе по сëавнению с 1- й , значительное уменьшение частоты ëаспëостëаненности гапло типов 102/602–8/15 в 3- й подгëуппе по сëавнению со 2- й и 3- й (20,6 %, 20,3 % и 10 % соответствен но ), 501/201/3 (11,8 %, 10,9 % и 5 %). В 3- й под - гëуппе пëи снижении частоты вышепеëечислен - ных гаплотипов наблюдался статистически значи мый ëост частоты гаплотипа 103/603–8/13 (2,94 % в 1- й подгëуппе , 7,8 % во 2- й и 12,5 % в 3- й соот ветственно ) и гаплотипа 503/301/11 (11,76 % в 1- й гëуппе , 21,9 % во 2- й и 17,5 % в 3- й ) ( ëис . 3).

распределение аллелей DQA1 в подгруппах

антигены

Рис . 1. РаспреÑеление аллей DQA1 в пοÑгруппах

-■-Подгру ппа 1

*Подгру ппа 2

* Подгру ппа 3

антигены

Рис . 2. РаспреÑеление DQB1 в пοÑгруппах

25,00%

20,00%

15,00%

10,00%

5,00%

0,00%

Распределение гаплотипов

■ Подгруппа1

■ Подгруппа 2

■ Подгруппа 3

102\602-8\15      101\503\14

101\501\4       501\301\11

гаплотипы

Рис . 3. РаспреÑеление гаплотипов

Исходя из полученных данных , можно сде лать следующие выводы :

• 1.    Πëи сëавнительном анализе ëаспëостëанен - ности антигенов HLA в изучаемой гëуппе и кон - тëольной получено достовеëное повышение часто ты встëечаемости аллелей гëупп DQA 301 и 103, аллели 501 локуса DQB1, гëуппы 4 и 8 локуса DRB1, что может опëеделять их ëоль в фоëмиëова - нии иммунного ответа пëи зачатии , имплантации и сохëанении беëеменности . Πëичем существенное значение для сохëанения беëеменности может иметь не только наличие опëеделенного аллеля , но и комбинация аллелей и гаплотипов одного паëтне - ëа и в паëе , что тëебует дальнейшего изучения .

• 2.    ЛИТ является эффективным методом пëе - одоления бесплодия как в виде монотеëапии , так и в сочетании с дëугими методами лечения ( ЭКО и ПЭ ) в случае , если совместимость паëтнеëов по системе человеческих лейкоцитаëных антигенов является главным фактоëом ненаступления беëе - менности – 71 %.

• 3.    Наличие в генотипе женщины таких гапло типов HLA II класса , как 102/602–8/15, 501/201/3 повышает шансы супëугов на самостоятельное зачатие и / или положительный ëезультат ЭКО . Πëисутствие гаплотипа 503/301/11 снижает шансы на самостоятельное зачатие , пëисутствие гаплоти па 103/603–8/13 снижает шансы успеха попыток экстëакоëпоëального оплодотвоëения . Это может быть связано с ëазличной степенью активации киллеëного ответа на уëовне маточных тëуб и / или эндометëия в момент имплантции .

ず итеëɑтÜëɑ

• 1.    Сиде¿ьникова , ゑ . ぜ . Споëные вопëосы ди агностики и теëапии пëивычныê выкидышей , обÜ - с¿ов¿енныê и½½Üно¿огически½и наëÜшени ½и / ゑ . ぜ . Сиде¿ьникова , ぞ . と . ТетëÜашви¿и , ゎ . Т . СÜêиê // ぜ атеëиа¿ы II ぜ е¢дÜнаë . конгëесса по ëепëодÜк - тивной ½едицине . – ぜ ., 2008. – Ⅽ . 126–127.

• 2.    ぷ аêгю¿ н , é . ず . Особенности систе½ы HLA в пëивычно½ невынашивании беëе½енности / é . ず . ぷ аêгю¿ н , ぞ . と . ТетëÜашви¿и , ん . ん . ん гад¢а - нова // ぜ атеëиа¿ы I ぜ е¢дÜнаë . конгëесса по ëе - пëодÜктивной ½едицине . – ぜ ., 2006. – Ⅽ . 236.

• 3.    ぷ аêгю¿ н , é . ず . づ о¿ь опëеде¿енныê анти генов и гап¿отипов систе½ы HLA, пëедëаспо - ¿агающиê к пëивычно½Ü невынашиванию беëе - ½енности / é . ず . ぷ аêгю¿ н , ぞ . と . ТетëÜашви¿и , ん . ん . ん гад¢анова // ぜ атеëиа¿ы I ぜ е¢дÜнаë . кон - гëесса по ëепëодÜктивной ½едицине . – ぜ ., 2006. – Ⅽ . 236–237.

• 4.    Kallen, C.B. Immune testing in fertility practice: Truth or deception? / C.B. Kallen, A. Arici // Curr Opin Obstet Gynecol. – 2003. – V. 15(3). – づ . 225–231.

• 5.    Placebo-controlled trial of active immunization with third party leukocytes in recurrent miscarriage / O. Christiansen, O. Mathiesen, M. Husth et al. // Act Obstet Gynecol Scand. – 1994. – V. 73 – づ . 261–268.

• 6.    Stephenson, M. Evaluation and management of recurrent early pregnancy loss / M. Stephenson, W. Kutteh // Clin Obstet Gynecol. – 2007. – V. 50(1). – づ . 132–145.

ぢ остÜпи¿а в ëедакцию 21 декабë 2010 Ç .